hplc法同时测定小半夏汤中6-姜酚、6-姜醇的方法研究

hplc法同时测定小半夏汤中6-姜酚、6-姜醇的方法研究

小半夏汤来自张仲景的《缺钱要领》。它仅由半夏、生姜两种药物组成，但有良好的止吐效果。因此，历代医家都称赞它是“呕吐之药”。目前对其的研究主要集中在药理药效方面。本课题组前期的研究发现,小半夏汤水溶性部位中含有多种具强烈生理活性的核苷类物质。该方中,生姜虽为臣药,但现代研究表明,其中所含的姜酚、姜醇类物质为其止呕主要活性物质。因此本实验对该方中6-姜酚和6-姜醇进行了测定,为全面研究小半夏汤作进一步的探索。1sartorisb211d型电子天平的表征Waters2690型高效液相色谱仪,996PDA检测器,Millennium32色谱管理系统;SartoriusBP211D型电子天平。甲醇为色谱纯,水为亚沸蒸馏水(自制);6-姜酚、6-姜醇对照品为由本实验室分离纯化制得的黄色油状物,经UV、IR、MS、NMR等结构测定,并经HPLC检测为单一成分,质量分数达到99%以上;小半夏汤由南京中医药大学中医药研究院提供。2方法和结果2.1色度条件的确定2.1.1最大吸收波长的确定采用紫外区全波长扫描的方法,对6-姜酚和6-姜醇的最大吸收波长进行研究,结果见图1。发现两者均在280nm处呈现最大吸收,因此确定了在280nm进行测定的方法。2.1.2检测波长和测量流量mm,5μm);流动相:甲醇-水(65∶35);检测波长:280nm;柱温:30℃;体积流量:0.8mL/min。理论塔板数以6-姜酚计不低于4000,并且6-姜酚、6-姜醇与其他组分的分离度均大于1.5。2.2溶液的制备2.2.1对照品贮备液的配制分别取减压干燥至恒重的6-姜酚、6-姜醇对照品适量,精密称定,加甲醇溶解,分别配成含6-姜酚6.365mg/mL、6-姜醇2.22mg/mL的对照品贮备液。2.2.2乙醇萃取法精密吸取装量差异项下的本品约40mL,置150mL分液漏斗中,加入等量无水乙醚,萃取两次,取乙醚层,蒸干,残渣用甲醇溶解,定量转移至25mL量瓶中,定容,摇匀,滤过,取续滤液,即得。2.3溶液中峰面积的测定分别精密吸取含6-姜酚6.365mg/mL、6-姜醇2.22mg/mL的对照品贮备液各0.2、0.6、1.0、1.4、1.8mL置10mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,制得系列混合对照品溶液。取10μL进样,测定峰面积。以进样质量对峰面积值作图,回归分析,结果6-姜酚在1.273~11.457μg有良好的线性关系,回归方程为Y=6.207×105X-1.998×104,r=0.9999;6-姜醇在0.444~3.996μg有良好的线性关系,回归方程为Y=3.273×105X-2.278×104,r=0.9998。2.4样品、对照品色谱条件考察按处方比例制得缺生姜的阴性样品,按供试品溶液的制备项下方法制备阴性样品溶液。按上述色谱条件分别取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液进样,记录色谱图,见图2。结果在与对照品色谱相对应处未出现色谱峰。表明按本实验条件,处方中的其他成分不干扰6-姜酚、6-姜醇的测定。2.5峰面积积分值的测定取供试品溶液(批号20071016)1份,重复进样6次,进样量10μL,记录所测各组分峰面积积分值,计算,结果6-姜酚、6-姜醇峰面积积分值的RSD分别为1.54%、1.43%。2.6-姜酚和6-姜醇质量浓度的测定取同一批样品(批号20071016)6份,制备供试品溶液,依法测定,计算各组分的质量浓度,结果6-姜酚、6-姜醇质量浓度的RSD分别为0.43%、1.48%。2.7进样稳定性试验吸取新配制的供试品溶液(批号20071016)1份,分别于0、2、4、6、8、10、12h进样,测定6-姜酚、6-姜醇的峰面积,结果其RSD分别为1.56%、1.41%,表明供试品溶液在12h内稳定。2.8加样回收率试验分别精密吸取装量差异项下的批号20071016本品约20mL,平行5份,精密加入含6-姜酚1.498mg/mL,6-姜醇498μg/mL的混合对照品储备液5.0mL,制备供试品溶液,按上述色谱条件进行HPLC测定,计算回收率,结果6-姜酚的平均回收率为99.82%,RSD为1.40%;6-姜醇的平均回收率为100.30%,RSD为1.44%。2.9样品测定取不同批号的小半夏汤制备供试品溶液。分别取供试品溶液和对照品溶液各10μL进样测定,以外标一点法计算质量浓度,结果见表1。3萃取溶剂的选择由于6-姜酚、6-姜醇在水中的溶解度很小,而在醚中和醇中的溶解度较大。因此在制备供试品溶液时,试验采用乙醚作为萃取溶剂。萃取过程中发现,用等