氯虫苯甲酰胺在甘蓝和土壤中的残留降解动态

氯虫苯甲酰胺在甘蓝和土壤中的残留降解动态

0抗寄生虫药物氯霉素胺是美国杜邦公司2000年开发的一种邻甲基苯基磺酰胺。它具有高效、低毒、广、环境相同等特点。对各种作物（如水稻、棉花）上的重要鳞状昆虫和其他昆虫的预防和治疗效果较好。氯虫苯甲酰胺对害虫具有新颖的作用机制,通过激活兰尼碱受体,释放平滑肌和横纹肌细胞内贮存的钙,引起肌肉调节衰弱、麻痹,直至害虫死亡;作用方式为胃毒和触杀作用。氯虫苯甲酰胺可有效防治已对其它杀虫剂产生了抗性的害虫,对非靶标节肢动物具有良好的选择性,从而能有效地保护捕食与寄生性天敌及传粉昆虫。【前人研究进展】氯虫苯甲酰胺5.0%悬浮剂和200g·L-1悬浮剂主要用于防治蔬菜害虫甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)、小菜蛾(Plutellaxylostella)等和水稻害虫稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocismedinalis)等,目前关于氯虫苯甲酰胺的研究主要集中在氯虫苯甲酰胺对害虫的作用机制、氯虫苯甲酰胺的毒力、田间防治效果及有效成分检测分析、在大豆植株中的内吸传导性、在部分水果蔬菜、水体及土壤等环境介质中的残留等方面。然而研究中采用残留样品前处理方法复杂、消耗大量的有机溶剂、不便于操作;检测方法中采用的是常规的高效液相色谱法等。【本研究切入点】农药在蔬菜上的残留降解动态和安全间隔期是农药残留与环境毒理学研究最备受关注的问题,对保障食品安全和田间科学安全用药具有重要的指导意义。【拟解决的关键问题】采用QuEChERS(quick,easy,cheap,effective,ruggedandsafe)样品前处理方法结合高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)检测技术,研究氯虫苯甲酰胺在甘蓝和土壤中的残留降解动态和最终残留量,明确氯虫苯甲酰胺在甘蓝上的施用剂量和安全间隔期,为正确使用氯虫苯甲酰胺制剂防治蔬菜害虫提供科学依据。1材料和方法1.1甲酰胺质量分数20%氯虫苯甲酰胺悬浮剂由杜邦农化有限公司(上海)提供,其中氯虫苯甲酰胺质量分数为20%。氯虫苯甲酰胺在甘蓝和土壤中的残留试验时间为2010年5—9月和2011年5—9月,试验地块为扬州大学试验农场甘蓝(Brassicaoleracea)地,甘蓝品种为春油1号。1.2试验设计降解动态和最终残留试验按照NY/T788-2004农药残留试验准则执行。1.2.1样本采集和处理试验区面积24m2,平分为2个区,分别用于20%氯虫苯甲酰胺悬浮剂喷雾处理和空白对照。施药方法:将20%氯虫苯甲酰胺悬浮剂喷雾处理,试验剂量为0.090g·m-2。另设空白对照(CK),每处理3次重复。分别于药后2h,1、3、5、7、14和21d,定时采集分析样本。甘蓝:采用对角线5点取样法采集甘蓝,取样量约2kg,样本写上标签并包装好后,切碎混合均匀,称量留取500g,写上标签装保鲜袋,放入-20℃低温冰箱,备用。土壤:将泥土转入瓷盆中,放入恒温箱60℃烘干后,用土壤粉碎机粉碎,过40目筛,混匀后称量缩分留取500g,写上标签装入保鲜袋,放入-20℃低温冰箱,备用。1.2.2空白对照ck将20%氯虫苯甲酰胺悬浮剂稀释后喷雾处理,试验剂量分别是0.045(常规剂量)和0.090g·m-2(高剂量),另设空白对照(CK),共3个处理,每处理3次重复,各个处理随机排列。至甘蓝收获前,采用对角线5点取样法,分别采集甘蓝植株和土壤,采样约2kg,带回实验室后,按照1.2.1中甘蓝植株和土壤的方法处理,备用。1.3试验仪器Agilent1200-6460型三重串联四极杆液相色谱-质谱联用仪:美国Agilent公司;BS210S型电子天平:德国Sartorius公司;SB-1000型旋转蒸发器:日本Eyela公司;THZ-82A型振荡机:江苏富华仪器有限公司。氯虫苯甲酰胺标准品(w=99.0%),美国Chemservice公司提供;无水硫酸镁、N-丙基乙二胺(PSA)、C18填料:迪马科技有限公司;甲醇、乙腈(色谱纯):美国Tedia公司;试验用蒸馏水经0.22μm的微孔滤膜过滤后使用。氯化钠(A.R):天津化学试剂厂。1.4氯虫苯甲酰胺添加量的确定分别称取5.0g甘蓝或土壤于匀浆杯中,再加入30mL乙腈,待处理的甘蓝或土壤在匀浆器上高速匀浆3min,在捣碎的各处理样品中加入氯虫苯甲酰胺溶液,使甘蓝或土壤样品中氯虫苯甲酰胺的添加浓度分别为5.00、1.00和0.20mg·kg-1。同时设置空白对照,每处理重复3次。1.5离心5min在上述处理的甘蓝或土壤样品中分别加入1.5g氯化钠和6g无水硫酸镁,涡旋振荡,在4000r/min离心5min。取上清液2mL到盛有150mg无水硫酸镁,50mgPSA和50mgC18的离心管中,4000r/min离心5min后,取离心后的上清液0.65mL,加入0.35mL水后混匀,0.22μm有机相滤膜过滤处理,待HPLC-MS/MS检测分析。1.6s/ms检测条件对上述1.5各试验组中的样品进行HPLC-MS/MS检测分析,借助相关的文献[21-22],结合仪器设备情况,对HPLC-MS/MS的检测方法进一步优化,优化后的氯虫苯甲酰胺的HPLC-MS/MS的检测条件为:三重串联四极杆液相色谱-质谱联用仪,AgilentEclipsePlusC18色谱柱(150mm×4.6mm,5μm);柱温:20℃;进样量:10μL;流动相:甲醇﹕含0.1%乙酸的5mmol·L-1乙酸铵溶液=65﹕35(V﹕V),流速:1.0mL·min-1。质谱条件:离子源:电喷雾电离源(ESI),正离子方式检测;检测模式:多反应监测(MRM);去簇电压:100V;干燥气体温度:300℃;干燥气体流速:10L·min-1;雾化气压力:15psi;鞘气温度:250℃;鞘气流速:7L·min-1;毛细管电压:4KV;喷嘴电压:500V。1.7氯虫苯甲酰胺初始浓度的计算氯虫苯甲酰胺降解反应动力学方程按一级动力学方程计算:式中:T1/2为降解半衰期,K为降解速率常数,C0为氯虫苯甲酰胺的初始浓度,Ct为t时刻氯虫苯甲酰胺的残存浓度。2结果2.1氯虫苯甲酰胺的检测试验中采用甲醇﹕含0.1%乙酸的5mmol·L-1乙酸铵溶液=65﹕35(V﹕V)为HPLC-MS/MS的流动相,正离子扫描反应离子监测模式检测氯虫苯甲酰胺,保证氯虫苯甲酰胺有较高灵敏度和准确度。在正离子检测方式下,氯虫苯甲酰胺以m/z484为母离子,进行二级质谱扫描,得到氯虫苯甲酰胺的特征碎片离子为m/z453、m/z286和m/z177。选取m/z286和m/z177为氯虫苯甲酰胺的定性离子,m/z453为氯虫苯甲酰胺的定量离子(表1)。2.2提取目标化合物乙腈作为一种通用的提取溶剂在残留检测方面得到广泛的应用,由于其对糖、蛋白质类化合物较难提取,对绝大多数农药有较高的回收率,因此本文采用乙腈作为提取试剂,以最大限度地提取甘蓝基质中的残留农药,并使提取液中的干扰物较少,以确保目标化合物的有效提取。在进行净化方法研究中,为了更好地除去色素等杂质,采用了不同的PSA(0、10、25、50、75和100mg)和C18的用量(0、10、25、50、75和100mg),研究结果表明随着PSA和C18用量的增加,色素等杂质含量降低,但氯虫苯甲酰胺的回收率降低,为了保持良好的添加回收率和除去色素的目的,采用乙腈作为提取溶剂,以PSA50mg、C1850mg和MgSO4150mg作为QuEChERS处理的吸附剂。2.3添加回收率和变异系数甘蓝和土壤中氯虫苯甲酰胺的添加回收率分别为81.25%—92.05%和82.92%—93.38%,变异系数分别为3.53%—4.49%和1.14%—3.64%(表2)。各样本的添加回收率和变异系数在允许范围内,符合农药残留分析的要求。在给定的检测条件下,甘蓝和土壤中氯虫苯甲酰胺的最小检测量为0.005mg·kg-1。2.4甘蔗和土壤中的氯昆虫苯甲胺残留2.4.1/973/97氯虫苯甲酰胺定性的离子对分别为484/286和484/177。与氯虫苯甲酰胺标准品的定性离子对相比,甘蓝样品的提取离子流色谱图均具有离子对484/286和484/177(图1—图4)。2.4.2提取离子对样品的影响与氯虫苯甲酰胺标准品的定性离子对相比,土壤样品的提取离子流色谱图均具有离子对484/453、484/286和484/177,研究表明在土壤中残留的物质是氯虫苯甲酰胺(图5—图8)。2.5氯虫苯甲酰胺的降解动态氯虫苯甲酰胺在甘蓝上的降解动态:2010年试验甘蓝上氯虫苯甲酰胺原始附着量是0.1888mg·kg-1,Ct=0.1915e-0.0895t,半衰期T1/2=7.74d,r=0.9822;2011年试验甘蓝上氯虫苯甲酰胺原始附着量是0.1792mg·kg-1,Ct=0.1791e-0.0915t,半衰期T1/2=7.57d,r=0.9761(表3)。因此氯虫苯甲酰胺在甘蓝上的半衰期T1/2=7.66d。氯虫苯甲酰胺在土壤中的降解动态:2010年试验土壤中氯虫苯甲酰胺原始附着量是1.8492mg·kg-1,Ct=0.1915e-0.0895t,半衰期T1/2=7.74d,r=0.9822;2011年试验土壤中的氯虫苯甲酰胺原始附着量是2.0099mg·kg-1,Ct=1.9987e-0.1160t,半衰期T1/2=5.98d,r=0.9913(表4)。因此氯虫苯甲酰胺在土壤中的半衰期T1/2=6.86d。2.6残留浓度的测定20%氯虫苯甲酰胺悬浮剂以0.045g·m-2施药时,氯虫苯甲酰胺在甘蓝和土壤中的最终残留浓度分别为未检出和0.0071mg·kg-1。0.090g·m-2剂量施药时,氯虫苯甲酰胺在甘蓝和土壤中的最终残留浓度分别为0.0063和0.1004mg·kg-1(表5—表6)。3氯虫苯甲酰胺的前处理本研究采用QuEChERS样品前处理方法结合HPLC-MS/MS检测技术,定性、定量研究氯虫苯甲酰胺在甘蓝和土壤中的残留降解动态和最终残留量,样品前处理方法简便、可行、快捷,HPLC-MS/MS检测技术准确可信。在试验前期采用二氯甲烷提取、浓缩、再甲醇溶解定容样品前处理方法,耗费大量的有机溶解,并且在进行高效液相色谱分析时,叶绿色等杂质对目标峰有一定的干扰,对色谱柱和检测器造成了不良影响。本研究的样品前处理方法方面与传统方法有所不同,采用的QuEChERS方法具有快速、简单、便宜、有效、可靠和安全等特点,减少了有机溶剂的使用量,减少了样品基质如叶绿素、油脂、水分等的干扰和仪器的影响,采用HPLC-MS/MS对氯虫苯甲酰胺进行定性、定量分析,定性的方法是通过二维质谱的定性离子对进行定性,具有良好的准确性、科学性和灵敏度。因此,此方法具有检测快速、准确等优点,且重现性、稳定性、分离效果均能满足有效成分和残留检测的要求。QuEChERS方法也是目前农药残留样品前处理研究的热点,本研究有效地将样品前处理方法与最新的仪器分析检测方法有机结合,研究氯虫苯甲酰胺的残留和降解动态,充分发挥了最新提取技术和检测技术的优点。关于农药残留样品的前处理有多种处理方法,如不同的有机溶剂提取、再柱层析净化、固相萃取、凝胶渗透色谱净化,但是这些提取、净化方法较复杂,消耗大量的有机溶剂,耗时长,成本高等不足,现在采用的可替代的前处理技术为QuEChERS。Anastassiades等提出了基于固相萃取和基质固相分散技术的QuEChERS检测方法,该方法主要有如下的优点:(1)作为一种多残留分析的方法可测定含水量较高的样品,减少样品基质如叶绿素、油脂、水分等的干扰;(2)稳定性好,回收率高,对大量极性及挥发性农药品种的加标回收率均大于85%;(3)分析时间短,能在30—40min内完成10—20个预先称重的样品测定;(4)溶剂使用量少,价格低廉,污染小;(5)方法十分严格,在净化过程中有机酸均被除去,对色谱仪器的影响较小等优点。目前,中国尚未制订氯虫苯甲酰胺在甘蓝中的最大残留限量值,可以借鉴其它国家制定的氯虫苯甲酰胺在蔬菜上的残留限制量,氯虫苯甲酰胺在番茄中的最大残留限量值美国、墨西哥和加拿大均规定为0.7mg·kg-1,国际食品法典委员会标准规定为0.6mg·kg-1,欧盟和澳大利亚规定为0.3mg·kg-1;日本规定氯虫苯甲酰胺在甘蓝中的最高残留限量为4mg·kg-1。在推荐使用剂量下,20%氯虫苯甲酰胺悬浮剂以0.045和0.090g·m-2剂量施药时,氯虫苯甲酰胺在甘蓝和土壤中的最终残留浓度符合残留要求。因此,参考相关国家残留标准和本研究的试验结果可制定氯虫苯甲酰胺在甘蓝中最大残留限量值为4mg·kg-1。此剂量下使用该药是安全的