姜类药材中3种药用姜中4种姜酚含量测定

姜类药材中3种药用姜中4种姜酚含量测定

生姜、生姜和生姜是生姜科的一种生姜。根及其加工产品对生姜的治疗效果不同，对中医的临床应用也有一定的不同。现代药理研究表明,姜具有镇痛抗炎、抗肿瘤、抗病原体、保肝利胆、抗溃疡、改善心血管系统等多种药理作用[1~3]。姜的主要成分为挥发油和无挥发性的姜辣素类化合物,2类化合物在组方入药的过程中均能产生药理作用。以6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚为代表的姜辣素类化合物是姜的特征性化学成分之一,研究证实姜酚具有强心、调节血管舒缩功能、抗血小板、降血脂、抗动脉粥样硬化、抗氧化与保护心肌等药理作用。目前,姜酚类成分的含量测定方法以高效液相色谱(HPLC)法为主,但以往的方法大多采用含酸的流动相体系,易使姜酚脱水形成姜烯酚,降低测定结果的准确性。另外,部分方法的前处理过程需要柱层析分离等步骤,较为烦琐[6~8]。本试验采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法,可以在20min内快速测定干姜、炮姜和生姜中6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚的含量,方法简便、准确、高效,能够为药用姜的加工炮制和质量控制提供参考和依据。1材料、药品和标准品Agilent1200型HPLC仪(美国安捷伦公司);AW120型电子天平(日本岛津公司);ZN-100微型高速粉碎机(中南制药机械厂);BRANSON5510E超声仪(美国必能信公司)。干姜(北京同仁堂饮片厂,批号:100520)、炮姜(北京同仁堂饮片厂,批号:100429)、生姜(购自农贸市场),经山西省药品检验所鉴定均为姜科植物姜Z.officinaleRosc.的根茎及加工品;6-姜酚(批号:E-0128)、8-姜酚(批号:E-0165)、10-姜酚(批号:E-0135)标准品(上海同田生物技术有限公司,经HPLC面积归一化法检查纯度均>98.5%);乙腈、甲醇为色谱纯,水为重蒸馏水,其他试剂均为分析纯。2方法和结果2.1流动相及色谱条件色谱柱:依利特HypersilODS2(250mm×4.6mm,5μm);流动相:乙腈-水(72∶28);流速:1mL·min-1;检测波长:280nm;柱温:25℃;进样量:10μL。在此色谱条件下,6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚与样品中其他组分的色谱峰分离完全。色谱见图1。2.2标准品贮备液的制备精密称取6-姜酚标准品11.56mg、8-姜酚标准品10.72mg和10-姜酚标准品10.31mg,分别置于10mL量瓶中,用甲醇定容,摇匀,即得标准品贮备液(6-姜酚为1.156mg·mL-1、8-姜酚为1.072mg·mL-1、10-姜酚为1.031mg·mL-1),置4℃冰箱贮藏,备用。2.3超声用量的确定干姜和炮姜粉碎后过4号筛,分别精密称取约0.15g;生姜适量切成碎末,用滤纸擦干表面汁液,精密称取约0.15g,分别置于10mL量瓶中,加甲醇45mL超声(功率:100W,频率:40kHz)处理20min,放冷至室温,加甲醇至刻度,摇匀,过0.45μm滤膜,取续滤液,即得。2.4回归方程的制备分别精密吸取“2.2”项下标准品贮备液0.1、0.5、1、10、20mL,置于100mL容量瓶中,加甲醇稀释,摇匀,按上述色谱条件分别进样10μL(每份重复进样3次),测定峰面积。以标准品浓度(X,μg·mL-1)为横坐标,峰面积积分值(Y)为纵坐标,制备标准曲线,得6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚的回归方程分别为Y=1.1377X+0.1265(r=0.9999,n=5)、Y=1.1126X+0.1343(r=0.9998,n=5)、Y=1.0968X+0.1564(r=0.9999,n=5)。结果表明,6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚的进样浓度分别在1.156～231.200、1.072～214.400、1.031～206.200μg·mL-1范围内与各自峰面积积分值呈良好的线性关系。2.5日性关系考察结果分别取3种姜酚低、中、高3种浓度标准品溶液,连续进样3次,考察方法的日内精密度。结果,6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚峰面积的RSD分别为0.25%、0.42%、0.52%(n=9);再连续3d进样,考察方法的日间精密度。结果,6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚峰面积的RSD分别为0.36%、0.63%、0.73%(n=9),表明方法的精密度良好。2.6峰面积的测定精密称取干姜粉末适量,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,分别于0、1、3、6、12、24h测定6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚的峰面积。结果,3种姜酚峰面积的RSD分别为0.89%、1.13%、1.05%(n=6),表明供试品溶液在24h内稳定。2.7制备供试品溶液精密称取干姜粉末适量,共6份,分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液,测定3种姜酚的含量。结果,6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚含量的RSD分别为0.55%、0.82%、0.49%(n=6),表明方法重复性良好。2.8加样回收率试验精密称取已知3种姜酚含量的干姜样品粉末适量,共6份,精密加入适量3种姜酚标准品贮备液,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,按上述色谱条件进行测定,计算加样回收率,结果见表1。2.9样品含量的测量精密称取干姜、炮姜和生姜样品粉末适量,分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液,按上述方法测定3种姜酚的含量,结果见表2。3提取方法的确定本试验对超声和回流等提取方法进行了比较,发现超声提取的3种姜酚成分含量要高于回流提取,分析其原因为加热回流提取会使姜酚类成分发生脱水转变,导致含量降低。另外,分别采用50%、75%和纯甲醇作为提取溶剂,发现纯甲醇对此类成分具有更高的提取效率。通过对超声提取时间的考察,发现到20min后3种姜酚的含量不再增加,可保证提取完全。故最终选择样品提取方法为加甲醇45mL超声处理20min。选择230nm和280nm特征波长进行比较,发现230nm处于吸收曲线的肩峰位置,易受到干扰;选择280nm作为检测波长,色谱图峰形较好、灵敏度高。同时,本试验比较了甲醇-水和乙腈-水流动相体系,从保留时间和分离度进行分析,结果发现乙腈-水体系的分离效果更好,3种姜酚的色谱峰与相邻色谱峰均可