拉曼光谱在血红蛋白研究中的应用

拉曼光谱在血红蛋白研究中的应用

血红蛋白结构与功能研究中拉曼光谱的应用血液不仅具有将氧气分配到身体各部分的重要生理功能，而且还具有调节ph值的能力。调整一氧化氮水平，参与免疫反应。尽管一直作为描述蛋白质结构与功能关系的重要范例,但是当前对血红蛋白的认识仍滞后于大量临床病例诊治的需求［１］。同时,鉴于血液安全保障形势日益严峻,血红蛋白氧载体(hemoglobin-basedoxygencarriers,HBOCs)作为红细胞代用品的主要类型,其研制为血红蛋白结构和功能的认识不断提出新要求［２］。拉曼光谱是一种与分子或晶格振动相关的光子非弹性散射光谱,可用于分子结构分析。在血红蛋白结构与功能研究中,拉曼光谱具有三方面突出优势:第一,样品准备简单,避免稀释液等对血红蛋白结构的影响;第二,可进行实时、原位检测,使在体或无损检测成为可能;第三,光谱信息量大,可同时分析不同化学键的振动方式。1972年Strekas和Spiro的工作揭开了拉曼光谱研究血红蛋白结构的新篇章［３］。近年来,血红蛋白中血红素平面及其与铁离子轴向配体键的拉曼光谱归属的深入研究,不仅为揭示血红蛋白反应动力学及相关机制奠定基础,还为病变血红蛋白的检测与诊断提供了实验依据,并可定量评估血氧饱和度和高铁血红蛋白含量。本文将从这些方面综述血红蛋白拉曼光谱的研究进展。1血红蛋白拉曼光谱峰位归属通过拉曼光谱峰位的归属分析可以得到官能团、化学键和电子密度等分子结构及其变化的信息［４］。由于血红素拉曼散射截面相对较大,因此血红蛋白的拉曼光谱主要反映血红素振动特征［５］。研究者们通过同位素标记血红素中铁离子、吡咯环中氮原子、次甲基中氢原子以及改变其周围取代基,结合血红蛋白拉曼光谱峰频率和强度变化,确定了血红蛋白拉曼光谱峰的归属。Abe等将对称性为D４ｈ血红素分子的核心卟啉环结构进行了简正坐标分析,为血红蛋白的拉曼光谱峰位归属提供了依据,其结果经整理列于表1中［６］。血红蛋白拉曼光谱受血红素环内电子密度、血红素中心尺寸(Hemecoresize)、铁离子自旋态以及铁离子-血红素环表面距离等影响发生变化。高频区(1200~1700cm－１)反映血红素环骨架振动模式,是血红素结构变化的敏感谱带;低频区(200~700cm－１)反映血红素平面和铁离子轴向配体键的微小变形(图1)［７］。1.1生物资本的热重wbf-甲基-n原子间关系及选择血红素环骨架振动模式可分为BandⅠ-Ⅵ(表2)。BandⅠ为血红素环内电子密度敏感谱带,其波数范围为1340~1390cm－１,是血红素氧化还原态的标志谱带,且不受自旋态影响,与四个吡咯环的相同呼吸振动有关,很大程度上归属于Cα—N的对称拉伸。当Fe的氧化态降低时,反馈到卟啉π＊轨道d电子随之增加,卟啉π电子密度降低,C—N伸缩振动频率降低,拉曼光谱中BandⅠ频率降低［６］。例如高自旋HbⅢF(氧化型Hb氟化物)和低自旋HbⅢCN(氧化型Hb氰化物)的BandⅠ频率出现在1373cm－１,高自旋的de-oxyHbⅡ(还原型脱氧Hb)的BandⅠ频率出现在1357cm－１［８］。出现在1470~1650cm－１的拉曼光谱峰反映了血红素中心与吡咯环N原子之间的距离。根据极化情况不同,该区段分为BandⅡ-Ⅵ,为血红素中心尺寸相关振动谱带。其中,极化、去极化及反常极化是由拉曼光谱中的退偏比(ρ１)决定的,ρ１<1/3为极化,ρ１=3/4为去极化,ρ１>3/4为反常极化［３，６］。这几种振动带是铁离子自旋态敏感谱带,受血红素环内电子密度影响小,主要受次甲基键伸缩振动的影响。BandⅡ,Ⅳ和Ⅴ与次甲基键(Cα—Cｍ和Cα—Cβ)拉伸模式有关,BandⅥ与Cβ—Cβ拉伸模式有关。当Fe离子由低自旋态变为高自旋态,Fe与吡咯环N原子之间距离增大,键长增长,血红素中心尺寸增大,dx２—y２反键轨道电子密度增高,BandⅡ,Ⅳ和Ⅴ频率左移［７］。已有研究提出BandⅡ-Ⅵ的拉曼频率与血红素中心尺寸大小呈线性关系［９］,即νｉ=Kｉ(Aｉ-RＣｔ—Ｎ),RＣｔ—Ｎ为血红素中心尺寸大小,表3为Kｉ和Aｉ测定参数。1.2fe—Fe-配体振动相关谱带在血红蛋白拉曼光谱中,Fe-配体振动相关拉曼谱带出现在400~650cm－１,这一区段拉曼频率与连接铁离子的配体、Fe-配体键相关。Chottard等［１０］对一氧化氮血红蛋白拉曼光谱的研究认为549cm－１峰归属于Fe—NO拉伸振动,该轴振动的拉曼强度来自于卟啉环Ⅱ电子向Fe—NO部分的离域。Yu等［１１］发现453,412,500和574cm－１分别归属于Fe(Ⅲ)—CN拉伸模式、Fe(Ⅲ)—C—N弯曲振动模式、Fe(Ⅱ)—CO拉伸模式和Fe(Ⅱ)—C—O弯曲振动模式。在Fe—N拉伸振动的研究中,Asher等和Tsubaki等［１２，１３］认为413cm－１处拉曼峰归属于Fe—N拉伸振动。Bayden等［７］通过研究红细胞拉曼光谱发现567和419cm－１处拉曼峰归属于Fe—O２拉伸振动模式和Fe—O—O弯曲振动模式。1.3fe—Fe-His(Fe-近端组氨酸)及蛋白质性质相关谱带Fe—His的共价键是血红素与蛋白质亚基连接的唯一桥梁,该键的变化影响血红蛋白的空间结构,从而改变血红蛋白的氧亲和力,因此它是区分R态(松弛态)和T态(紧张态)重要的标志峰。Fe—His拉伸模式出现在拉曼光谱低频区,在脱氧血红蛋白中,Fe—His拉伸模式出现在200~225cm－１,T态时Fe—His拉伸模式移至215cm－１附近,R态时Fe—His拉伸模式移至221cm－１附近［１４］。具有蛋白质性质的血红蛋白拉曼谱带则出现在高频区,1630~1670,1240~1267,1003,1446cm－１分别与酰胺Ⅰ、酰胺Ⅲ、苯丙氨酸以及氨基酸侧链CH２/CH３变形相关［７］。2血红蛋白反应动力学的特征血红蛋白通过三、四级结构细微变化引起变构效应继而发挥生物学功能。早期齐变模型及序变模型理论［１５－１７］已初步诠释了血红蛋白在R-T转换过程中四级结构的变化,然而血红蛋白携/放氧反应的详细过程及机制尚不清楚。因此,明确血红素连接与蛋白质构象变化关系成为研究血红蛋白变构效应的目标［１８］。近二十年内,时间分辨光学吸收光谱法、时间分辨圆二色谱、时间分辨磁圆二色谱、时间分辨广角X射线及时间分辨拉曼光谱等方法进一步阐明了血红蛋白在R—T转换中三、四级结构内部的变化。其中血红蛋白拉曼光谱可选择性地监测酪氨酸残基、色氨酸残基及Fe—His拉伸的振动模式。另外,BandⅠ振动模式(与血红素环内电子密度相关的特征谱带)可以反映卟啉环和血红素口袋周围π电子作用,是协同效应能量变化的基础,皆有助于揭示血红蛋白反应动力学具体过程。应用拉曼光谱技术监测血红蛋白R—T态转变过程分为Rｄｅｏｘｙ,Rｓ,RＴ,T′几个阶段［１９］。血红蛋白变化第一步生成中间产物“Rｄｅｏｘｙ”,其拉曼光谱与一个或多个亚基失去配体时拉曼光谱特征相似,但血红蛋白四级结构仍为R态,色氨酸和酪氨酸相关谱带强度降低,推测是由血红蛋白三级结构中E—A和F—H之间氢键断裂造成的。此时Fe—His键松弛或断裂,但血红蛋白四级结构还未改变。第二步生成中间产物“Rｓ”,据推测H和A螺旋移动时可能形成新的氢键。第三步生成中间产物“RＴ”,蛋白质构象开始变化,内部二聚体开始旋转,α１链FG转角与β2链C螺旋之间形成“铰链”结构［８］。拉曼光谱显示了色氨酸β35与精氨酸α94发生“链”式接触,形成氢键。蛋白质变化第四步形成中间产物“T′”,此时拉曼光谱反映了α1链C螺旋中酪氨酸α42与β2链FG转角中精氨酸β99之间形成氢键,标志T态的完全转化［２０，２１］。由于血红蛋白四个亚基成对重组,仍有配体未与1~2个血红蛋白亚基分离,因此将其标记为T′。此外,α亚基νＦｅ—Ｈｉｓ拉曼频率在Rｄｅｏｘｙ,Rｓ,RＴ间基本不发生变化,T′态时拉曼频率迅速降低,而β亚基νＦｅ—Ｈｉｓ拉曼频率则逐级递减［２０］。实时监测血红蛋白反应动力学的时间分辨拉曼光谱可获得这几个阶段反应时间,不同研究组实验结果有微小差异(表4)［２２］。这可能与实验条件、环境和仪器设备等因素有关。这些实验数据为阐明血红蛋白四级结构的变化机制提供了有效依据。3拉曼光谱法在血液激活功能研究中的应用3.1氧合血红蛋白特征峰血氧饱和度反映全身氧供需平衡状态及组织代谢情况,利用氧合、脱氧过程中血红蛋白拉曼光谱ν４,ν１０,ν１９特征峰位移的特点,建立体内外定量测定血氧饱和度的方法。拉曼光谱中脱氧血红蛋白ν４,ν１０和ν１９特征峰出现在1360,1605和1555cm－１附近,氧合血红蛋白ν４,ν１０和ν１９特征峰出现在1375,1640和1585cm－１附近。由此,Torres等［２３］计算ν４,ν１０,ν１９三处特征峰的PR值(peakratios峰比率),即PRｎ=[Iｎｏｘｙ/(Iｎｄｅｏｘｙ+Iｎｏｘｙ)]×100(Iｎｏｘｙ,氧合血红蛋白在νｎ处拉曼峰强度;Iｄｅｏｘｙ,脱氧血红蛋白在νｎ处拉曼峰强度),发现体内外不同浓度血红蛋白拉曼光谱中PRｎ值与血氧饱和度之间均呈良好的线性相关,证实了拉曼光谱技术应用于人体组织血氧饱和度无创监测的可行性。3.2u3000血红蛋白拉曼光谱技术红细胞内血红蛋白与糖类物质(主要是葡萄糖)通过非酶促作用形成糖化血红蛋白(glycatedhemoglobin,GHb),包括HbA1a1,HbA1a2,HbA1b和HbA1c,其中HbA1c含量最多,与平均血糖波动直接相关。阳离子交换层析法、电泳法、等电聚焦法、亲和层析法、免疫法等现有检测方法易受各种因素干扰,结果的准确度、重复性、精密度有待提高［２４］。近两年研究表明拉曼光谱检测GHb具有无需添加试剂、灵敏度和精确度高等优势,有望克服现有方法的缺陷［２５，２６］。已有研究采用表面增强拉曼光谱发现HbA1c相比于HbA在770~830cm－１处特征峰发生变化［２７］,为建立新型HbA1c检测技术提供了新思路。血红蛋白受恶性疟原虫分解代谢为游离血红素,经氧化形成高铁血红素(ferriprotoporphyrinIX,FPIX),后者具有细胞毒性。疟原虫促进FPIX聚集,形成对自身无害的疟原虫色素［２８］。Bayden等发现了780nm激光下疟原虫色素拉曼光谱ν４特征峰(1374cm－１)显著增强,使拉曼光谱法用于疟原虫色素研究成为可能［２９］。随着抗疟药物氯喹的治疗,疟原虫色素A１ｇ和B１ｇ模式拉曼光谱峰强降低［３０］。针尖增强拉曼光谱增强了探测疟原虫色素的灵敏度,便于获取纳米级的分子信息,为抗疟药物作用靶点的筛选提供一个新方法［３１］。地中海贫血是由于患者编码珠蛋白链的基因发生缺陷或缺失,部分珠蛋白链无法合成而造成遗传性溶血性贫血。现有临床诊断分析程序繁琐,诊断周期较长。王桂文等［３２］应用主成分分析法(PCA)分析了地中海贫血红细胞的拉曼光谱,重型a地中海贫血患者不同红细胞间的拉曼光谱差异较大,1388,1369,1244,970cm－１等血红素凝集的标志峰显著升高,而蛋白质结构的拉曼信号显著降低。同时,利用反映血红蛋白氧合/脱氧态的I１u3000６３８/I１u3000５４７分析了地中海贫血红细胞和正常红细胞的携氧能力,发现地中海贫血红细胞的氧亲和力增强。这些研究说明血红蛋白拉曼光谱可成为地中海贫血的诊断工具。血红蛋白中β链第6位谷氨酸被缬氨酸所取代形成了血红蛋白S(HbS),由其引发的镰形细胞病在血红蛋白病中占有重要地位。当HbS被氧合时,其结构和功能与正常血红蛋白相似,然而HbS脱氧后经历分子重排过程导致不溶胶形成,使红细胞扭曲成镰形变异体。基于HbS结构的药物设计需要获得多聚体最佳断裂位点,又由于拉曼光谱可提供血红蛋白三、四级结构变化的具体信息［３３］,因此运用拉曼光谱技术可以监测HbS不溶胶形成过程中血红蛋白分子间盐键形成、氢键连接、非极性和疏水结构域等［３４－３６］变化,以便进行靶向药物的筛选。4影响测量结果的因素拉曼散射信号较弱,并且是绝对测量得到的。激光波长、激光功率、曝光时间、样品温度、聚焦光斑的大小及浸没深度等因素皆会增加测量误差,影响测量结果的稳定性。控制影响血红蛋白拉曼光谱测量的因素有望提供一个稳定的检测环境,提高分析测试的准确性和重复性,下面将逐一进行讨论。4.1白拉曼光谱检测血红蛋白中生色团由于血红蛋白在α,β和Soret带有特征吸收,当激光频率位于上述吸收带内,拉曼光谱中100~1700cm－１之间拉曼峰增强,发生共振拉曼效应,可提高检测灵敏度［３７］。不同激光波长血红蛋白拉曼光谱峰可选择性增强血红蛋白中生色团的振动模式。Sato等［３７］发现514.5nm波长激光下血红蛋白特征表现受到较大干扰,720nm波长激光下拉曼光谱主要表现血红素结构特点,1064nm波长激光下拉曼光谱主要表现血红素和蛋白质的特征。Bayden等研究了632.8,780,1064nm波长激光下HbS的拉曼光谱及488,514,568,633,785nm波长激光下红细胞的拉曼光谱,推测较低波长(如488,514,568和633nm)激光下,拉曼光谱以血红素的共振增强效应为主,较高波长(如780,785和1064nm)激光下,蛋白质谱带特征开始出现［７］。4.2功率激光对血红素的影响激光功率越大,拉曼信号越强,但易引起血红蛋白变性;激光功率小,虽避免了血红蛋白变性但拉曼光谱信噪比降低。Bayden等［７］发现24mW功率激光会使细胞内蛋白质变性导致血红素聚集,而18mW功率激光下拉曼光谱信噪比最高。本课题组研究了激光功率范围在0.1~100mW之间的牛血红蛋白显微共焦拉曼光谱,功率升高拉曼光谱信噪比增强,但激光功率大于50mW时拉曼光谱基线会发生变化,提示血红蛋白可能发生了变性。4.3光斑浸没的影响当采用显微拉曼光谱研究血红蛋白时,聚焦光斑的大小及光斑浸入样品的浸没深度对实验结果也有显著的影响。聚焦光斑小,单位体积样品获得能量大,高能量密度能会使红细胞溶血,从而改变血红蛋白化学键,引起光解离效应;聚焦光斑大,单位体积样品获得能量小,不易受激光灼烧。而光斑浸没深度的影响与样品的透明度有关。血红蛋白样品的透明度往往较低,浸没深度较大时,样品对激光的吸收及散射较大,导致拉曼信号信噪比降低［２３］。这一效应也与激光波长有关,波长较长的激光受浸没深度的影响较小。发现514.5和785nm激光下,0,50,100,200μm四个光斑深度得到的血红蛋白拉曼峰频率基本相同,但514.5nm激光下的拉曼峰强度随光斑深度增大而降低,785nm激光下光斑深度变化对拉曼峰强度影响不大,但低光斑深度会造成样品局部受激光灼伤变性。4.4长激光下人红细胞的生长曝光时间短,血红蛋白不易变性但信号弱;曝光时间长,易引起蛋白质变性。Dasgupta等［３８］观察近红外波长激光下人红细胞拉曼光谱,发现长时间曝露在激光下会使蛋白质变性、高铁血红素形成以及细胞内血红素聚集。Bayden等［７］发现延长曝光时间,1639,1620,1547,1566,1547,1212,1003和755cm－１处特征峰强度降低。其中1639cm－１处拉曼强度降低说明延长曝光时间会导致样品氧化。4.5血红蛋白浓度拉曼强度随着血红蛋白浓度升高而增强,但过高浓度的血红蛋白溶液导致激发光穿透力下降。Spiro等［３］认为要得到高信噪比的拉曼光谱,血红蛋白浓度应控制在10－３~10－５mol·L－１之间。温度会影响拉曼峰高度、宽度、退偏振率和累积面积。Cho,Tsubaki,Ondrias等［１３，３９，４０］均考察