固定化胰蛋白酶水解乌肉鸡工艺研究

固定化胰蛋白酶水解乌肉鸡工艺研究

兔子也被称为乌骨鸡。这是一种双重药物和营养的饲料。乌江富含蛋白质、脂肪、钙、铁、磷、v1、vb2等。特别是在乌鸡皮、骨和肉中含有大量黑色素,现代医学研究认为乌鸡的药用价值和食用价值与体内的黑色素物质有关,其主要功能是滋补、强身、健体、抗衰防老。同时在乌鸡肉中含有17种氨基酸,其中13种高于普通鸡。我国已广泛开发的乌鸡白凤丸,是传统药物中著名的滋补中成药。传统的制备乌鸡药物的方法多是将乌鸡直接蒸煮,再加工成各种产品,此种工艺不仅使乌鸡有效成分利用率低,而且药物中杂质多、色泽深和有效成分低。近年来,采用酶法水解乌鸡肉制备出多种药物及功能食品,可以提高乌鸡肉利用率,改善药物品质。本实验利用固定化酶酶工程技术,水解乌鸡肉制备具有抗氧化、促进脂质代谢、降低胆固醇、增强机体免疫力等作用的功能肽,探讨水解乌鸡肉的工艺条件,为乌鸡肉的综合开发与利用提供技术参考。1材料和方法1.1上海化学试剂乌鸡由徐州市七里沟农贸市场购买。胰蛋白酶(3000U/g)杭州三叶生物化工厂;海藻酸钠上海化学试剂站分装;戊二醛天津福晨化学试剂厂;无水氯化钙天津基准化学试剂有限公司;聚醚砜超滤膜北京安德膜技术有限公司;其他试剂均为国产分析纯。1.2实验设备TU-1810PC型紫外分光光度计北京普析通用仪器有限公司;HYG-I转式恒温调速柜上海欣蕊自动化设备有限公司;DZF-6020型真空干燥箱上海精密实验设备有限公司;FlowMemD250小试平板超滤膜设备福建厦门世达膜科技有限公司;DL-5低速大容量离心机上海安亭科学仪器厂。1.3方法1.3.1固定化酶活性测定乌鸡肉→蒸煮(30min)→粉碎打浆→称重→调pH7.5→加固定化胰蛋白酶→恒温振荡4h→过滤去除固定化酶微粒→离心分离(4800r/min)→上清液测氨基氮(AN)1.3.2固定化胰蛋白酶活力将海藻酸钠和胰蛋白酶分别溶于Tris-HCl缓冲液中,37℃使海藻酸钠溶化,按一定比例与胰蛋白酶混合,4℃静置过夜,吸入注射器内逐滴滴入2%氯化钙溶液中,移入4℃冰箱硬化4h,过滤洗涤,加入3%的戊二醛溶液交联6h,水洗,将残余戊二醛洗去,测定固定化胰蛋白酶活力,4℃冰箱保存备用。1.3.3固定化胰蛋白酶的活力测定以苯甲酰L-精氨酸乙酯(BAEE)为底物用紫外分光光度法测定,在酶反应时保持搅拌状态使混合均匀。1.3.4游离氨基酸氮含量的测定采用甲醛法测定乌鸡肉酶解液中氨基氮(AN)的含量。1.3.5功能肽超滤工艺流程按蒋菁莉等的方法按说明安装超滤装置,取3kD的聚醚砜超滤膜及连接管,先用0.3%NaOH溶液处理,然后对经过处理的功能肽粗品用3kD膜组件以全面回流的方式进行超滤,在0.08MPa压力以下,收集超滤液。1.3.6固定化因素的筛选根据相关文献资料,以海藻酸钠浓度、加酶量、pH值和温度等对胰蛋白酶固定化影响较大的因素为考察因素,选定L9(34)正交表进行试验,因素水平如表1所示。1.3.7固定化胰蛋白酶法解决乌拉鸡的因素选择根据单因素试验结果,综合考察主要因子以及不同水平的互相作用对乌鸡肉水解的影响,L16(45)正交表进行试验,因素水平如表2所示。1.3.8固定胰蛋白酶的稳定实验利用固定化胰蛋白酶水解乌鸡肉,重复使用后测定水解液中氨基氮的含量,观察酶活力保持50%以上的最高使用次数。1.3.9功能肽洗脱曲线测定经过截留分子量为3kD超滤后的乌鸡肉蛋白功能肽滤液,通过SephadexG-25凝胶层析柱(1.5cm×80cm),用10%乙醇溶液为洗脱剂,控制流速为20ml/h,以每管3ml收集洗脱液,在280nm波长处测光密度值,得到超滤液的功能肽洗脱曲线。2结果与分析2.1固定化胰蛋白酶项目的选择2.1.1海藻酸钠固定化胰蛋白酶效果海藻酸钠浓度对固定化酶凝珠的机械强度、质量传递等有直接影响,利用不同浓度的海藻酸钠固定化胰蛋白酶效果,结果见表3。由表3可知,当海藻酸钠浓度为4%时,成球容易,凝珠强度适中,球形状圆型,酶活力回收率最高为33.12%,故选择4%的海藻酸钠。2.1.2固定化效果的确定通过正交试验优化固定化胰蛋白酶的工艺条件,结果如表4所示。由表4极差分析可知,各个因素对固定化效果的影响顺序为A>B>C>D,即海藻酸钠>加酶量>pH值>温度。最优方案为A2B2C3D2,即海藻酸钠浓度4%,加酶量10%、pH7.5、温度70℃,按优选工艺A2B2C3D2重复3次,酶活力回收率为38.84%,表明实验所确定的最佳工艺为较优工艺。2.2固定胰蛋白酶有助于吴肉的处理2.2.1乌鸡的固定化酶水解结果选用pH7.5、固液比1:4、温度60℃、时间6h,加入不同量的固定化酶水解乌鸡肉,结果见图1。由图1可知,随着酶用量的增加,氨基氮含量增加,当加入10%固定化胰蛋白酶时,对乌鸡肉的水解效果最好,氨基氮最高为1.87mg/ml,故酶用量选10%。2.2.2不同固液比对乌猪肉选用pH7.5、加酶量10%、温度60℃、时间6h,不同的固液比水解乌鸡肉,结果见图2。由图2可知,随着固液比的增加,氨基氮含量增加,固液比1:4时,氨基氮含量最高为2.11mg/ml,故固液比选1:4。2.2.3不同ph值对乌猪肉的水解效果选用加酶量10%、温度60℃、时间6h、固液比1:4,不同的pH值水解乌鸡肉,结果见图3。由图3可知,固定化胰蛋白酶水解乌鸡最适pH7.5,氨基氮含量最高为1.97mg/ml。2.2.4不同温度对鸡水解过程中活性成分的影响选用pH7.5、固液比1:4、时间6h、酶用量10%,不同温度水解乌鸡,结果见图4。由图4可知,固定化胰蛋白酶水解乌鸡肉最适温度为60℃,氨基氮含量为2.10mg/ml。2.2.5不同时间水解乌鸡肉选用pH7.5、加酶量10%、固液比1:4、温度60℃,不同时间水解乌鸡肉,结果见图5。由图5可知,随着水解时间的延长,水解率逐渐升高,固定化酶水解乌鸡肉的最佳时间为6h,氨基氮含量最高为2.10mg/ml。2.3氨基氮含量的影响采用正交优化固定化胰蛋白酶的最佳条件组合,水解乌鸡肉,结果见表5。由表5极差分析可知,各个因子对水解乌鸡肉氨基氮含量的影响为C>A>B>D,即加酶量影响最大,其次是固液比和pH值,温度影响最小。最优方案为A1B2C1D3,即固液比1:3、pH7.5、加酶量是10%、温度60℃,按优选工艺A1B2C1D3重复3次实验,氨基氮含量平均为2.18mg/ml,表明实验所确定的水解工艺为较优工艺。2.4固定化胰蛋白酶水解乌鸡采用固定化胰蛋白酶水解乌鸡肉,重复使用后,检查对乌鸡肉水解保持50%酶活力的使用次数,结果见图6。由图6可知,使用固定化胰蛋白酶水解乌鸡肉,第1次水解液中的氨基氮含量为2.10mg/ml,当使用到第8次后氨基氮的含量仍为1.08mg/ml。固定化胰蛋白酶的活力保持在50%左右,说明固定化胰蛋白酶具有良好的稳定性。2.5测定波长的测定采用3kD的超滤液,经SephadexG-25凝胶层析柱分离,用10%乙醇溶液洗脱,在280nm波长处测定光密度,结果见图7。由图7可以看出,经3kD超滤后的乌鸡肉蛋白功能肽溶液,经10%乙醇洗脱后出现两个峰,分别在100min和250min时出现,在100min时出现的峰I的强度大,250min时出现的峰II强度较小。由此看出,经3kD滤膜超滤后的功能肽可能是由两种类型结构相近的肽组成。3结论3.1采用氯化钠酸钠为保险丝固定胰蛋白酶的最佳工艺条件海藻酸钠浓度4%、加酶量10%、pH7.5、