青龙衣提取物及其分离成分抗肿瘤作用的初步筛选

青龙衣提取物及其分离成分抗肿瘤作用的初步筛选

龙庆银是属于桃园科的一种含有坚果的温和果皮。近年来,被广泛用于临床治疗肿瘤等疾病,但是对青龙衣提取及有效部位分离的研究尚少见有关报道。因此,通过对青龙衣进行提取及初步分离,并且对提取物及分离成分采用MTT法和SRB法对人白血病细胞株HL60、人胃癌细胞株BGC823及人宫颈癌细胞株Hela进行筛选,以期得到具有体外抗肿瘤活性的有效成分部位。1材料表面1.1仿生药物筛选人白血病细胞株HL60、人胃癌细胞株BGC823及人宫颈癌细胞株Hela:北京大学医学部天然药物与仿生药物国家重点实验室体外活性筛选中心提供。3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑(MTT,噻唑蓝):瑞士Fluka公司出品。RPMI-1640培养基干粉:美国GIBCO公司出品。胰蛋白酶:美国Serva公司出品。胎牛血清:深圳晶美分公司出品。1.2龙衣衣提取物的制备对于青龙衣的化学成分的提取与分离,采用分步提取法对其进行试验:即将青龙衣生药材,先粉碎成药材粗粉,再用乙醇和氯仿提取,然后用沸腾的乙醇提取得到提取物,将提取物依次用石油醚、氯仿、醋酸乙酯、正丁醇与水萃取,得到5个粗提部分。分别以青龙衣总提取物及5个粗提部分为受试样品,分别配制成0.1,1,10,100μg·mL-1溶液;以空白溶液为对照进行抗肿瘤初步筛选。1.3细胞株hela将人白血病细胞株HL60、人胃癌细胞株BGC823及人宫颈癌细胞株Hela,在含有1%胎牛血清的RPMI-1640培养液中,37℃,5%CO2条件下培养;隔天换液,贴壁细胞用0.25%胰蛋白酶消化后传代。1.4药集团制药六厂氯化钠注射液(250mL),哈药集团制药六厂,批号030256。山梨醇甲酯(500mL),天津市化学试剂工厂,批号021112。1.5实验动物昆明种小鼠,雌雄各半,体重(18±2)g,由哈尔滨市汉方实验鼠类养殖所提供,动物检疫合格证编号03-3001。2方法2.1实验分组和给药量根据预试结果,将受试样品设5个剂量组,青龙衣总提取物和青龙衣石油醚萃取物、正丁醇萃取物和水萃取物4部分,每部分剂量组分别设计为3.62,4.25,5.00,5.88,6.29g·kg-1。青龙衣氯仿萃取物剂量组设为400.2,470.6,553.6,651.3,766.3mg·kg-1。青龙衣醋酸乙酯萃取物剂量组设为930.2,1094.4,1287.4,1514.7,1781.9mg·kg-1,剂距为0.85。每组10只小鼠,雌雄各半。将青龙衣石油醚萃取物和青龙衣氯仿萃取物用含有10%山梨醇甲酯的氯化钠注射液充分溶解受试样品,配制成所需浓度,按0.01mL·g-1等容量不等浓度1次性灌胃给药,连续观察14d,逐日观察记录小鼠的毒性反应和死亡情况,用Bliss法LD50软件计算半数致死量。死亡动物作尸体剖检。青龙衣的其他提取物均用氯化钠注射液配制成所需浓度,按0.01mL·g-1等容量1次性灌胃给药,连续观察14d,逐日观察记录小鼠的毒性反应和死亡情况,用Bliss法LD50软件计算半数致死量。死亡动物作尸体剖检。2.2mtt法检测a值肿瘤细胞株在37℃,5%CO2条件培养箱中培养24h后,加入相应药物。细胞在100%湿度,5%CO2,95%空气的培养箱中连续培养48h,然后加入10μL5g·L-1的MTT溶液,继续培养;4h后仔细吸去上清液,加入二甲基亚枫100μL/孔,轻轻振荡以使溴代噻唑蓝完全溶解,约1h后在570nm波长处用酶标仪测其吸光度(A)值,测定时需减去空白对照的A值。细胞生长抑制率(%)=(1-A样品组/A对照组)×100%。2.3氯醋酸细胞a值的制备细胞接种和药物处理同MTT法,空白对照液只加完全培养液,不加细胞。药物处理48h后,每孔加入50μL冰冻的50%三氯醋酸。4℃固定1h后,用自来水洗去三氯醋酸、培养剂、小分子量代谢产物以及血清蛋白。将培养板纸在空气中干燥,用0.4%SRB(1%醋酸溶解)对三氯醋酸固定的细胞染色30min,随后用1%醋酸洗去游离染料,置于空气中干燥样品;每孔加入150μL10mmol·L-1Tris,轻轻振荡,直至染料全部溶解。于564nm波长处测A值,测定时应减掉空白A值。细胞生长抑制率计算方法同2.1。3小鼠急性毒性试验小鼠口服总提取物及青龙衣5个粗提部分受试样品后无其他异常现象。给药1d后,小鼠自主活动稍有减少,随着剂量的增大其程度加剧。于给药3d后恢复正常;所有剂量组均未出现死亡现象。腹腔注射青龙衣总提取物和青龙衣石油醚萃取物、正丁醇萃取物和水萃取物后,高剂量组小鼠30min后活动开始减少。给药1d后,小鼠活动减少,眼睛颜色发暗甚至发黑。随着剂量的增大其程度加剧,呼吸急促;不活动时,高剂量组动物毛竖立。低剂量组动物的情况于给药3d后恢复正常;高剂量组于给药后第5天全部恢复正常。溶剂对照组,给受试验品后,小鼠无异常情况发生,活动自如,正常饮食。腹腔注射青龙衣氯仿萃取物和青龙衣醋酸乙酯萃取物后,高剂量组小鼠自主活动开始减少,15min后出现扭体现象。给药后,小鼠主要异常表现为:自发活动减少,呼吸急促,运动失调,随着剂量的增大其程度加剧。高剂量组动物呼吸抑制,几乎不活动。低剂量组动物于给药4d后恢复正常;高剂量组存活动物给药第5天后恢复正常。动物开始死亡的时间在10h以上,最长的死亡时间是给药后第6天;动物死亡时身体瘦弱,死亡动物尸检主要脏器未见异常。小鼠腹腔注射青龙衣氯仿萃取物LD50为575.38mg·kg-1,可信限为558.11~592.64mg·kg-1;青龙衣醋酸乙酯萃取物为1303.59mg·kg-1,可信限为1264.48~1342.70mg·kg-1。青龙衣总提取物及青龙衣5个粗提部分:石油醚、氯仿、醋酸乙酯、正丁醇及水对人白血病细胞株HL60、人胃癌细胞株BGC823及人宫颈癌细胞株Hela作用有明显差异,结果见表1。从表中可以看出,青龙衣总提取物及青龙衣5个粗提部分中石油醚、正丁醇及水对人白血病细胞株HL60、人胃癌细胞株BGC823及人宫颈癌细胞株Hela作用效果虽然不同,但是,在给受试药物的最大剂量下,其细胞抑制率均<50%,说明青龙衣总提取物及青龙衣粗提部分:石油醚、正丁醇及水对人白血病细胞株HL60、人胃癌细胞株BGC823及人宫颈癌细胞株Hela无明显的细胞毒作用。4制备龙头企业,扩大青马林青肉的萃取和体外毒力本次实验结果表明,中草药青龙衣在经过提取分离后,各部分对小鼠的毒性作用各不相同,口服青龙衣以及其提取物在小于5g·kg-1时未出现死亡现象,说明青龙衣是一味毒性小、安全范围较大的中草药。同时,腹腔注射青龙衣总提取物及各部分萃取物,其LD50各不相同变化较大,说明通过对青龙衣的分离,将具有毒性作用的青龙衣萃取产物单独分离出来,确定青龙衣氯仿萃取物和醋酸乙酯萃取物腹腔注射对小鼠具有毒性作用,为其进一步药效及作用机制的实验研究提供依据。随着分子肿瘤学研究的不断深入,体外抗肿瘤实验已成为抗肿瘤药物研发过程中必不可少的一部分。本次实验选用3种与临床应用有较好一致性的肿瘤细胞株进行细胞毒性试验,以提高青龙衣抗肿瘤研究的可信度,同时为青龙衣的进一步研究提供依据。结果表明,青龙衣的氯仿粗提部分和醋酸乙酯粗提部分对白血病细胞株HL60