基于mdna控制区的乡土绿壳蛋鸡遗传多态性分析

基于mdna控制区的乡土绿壳蛋鸡遗传多态性分析

乌江，又名乌骨鸡，是中国鸟类品种的基本特征。经过长期的生存，所有族裔群体形成了中国丰富多样的乌骨遗传资源。根据明代的本草纲目，乌骨鸡有白色的骨头，黑毛的骨头，斑点状的骨头，肉和白骨的骨头。然而，鸡和舌黑的人是乌骨。他们有很好的药物，甜、平、无害，对压力、疲劳和虚弱有很好的抵抗力，治疗口渴，帮助孕妇，处理各种疾病。2011年版《中国动物遗传资源》列出了近17种乌肤乌江（不包括某些乌肤品种）。其中，东乡绿壳蛋蛋位于江西省东乡县，羽毛呈黑色，很少有个体的羽毛呈白色、麻痹或黄色。直立王冠，冠状面，树皮，肉，骨，足部和脚趾，主要是黑色。成年公鸡的体重为719g，鸡体重为1350g。东乡绿壳蛋的独特特征是外壳的颜色是绿色的。20世纪80年代以来，原生区采取了提取、对外贸易等措施，使其基本相同。每年生产约160枚蛋，绿壳率达到99%以上，并形成一定的产业规模。线粒体DNA(mtDNA)是一种核外遗传物质,长约16.5kb,与核DNA相比,mtDNA具有相对分子质量小、结构简单、进化快、母性遗传、无组织特异性等特点.其中,控制区(D-loop区)为非编码区,富集A/T碱基,能被RNA聚合酶等特异分子识别,从而作为转录的起始序列,其进化速率较其他区域高5~10倍［３］.因此,mtDNA控制区多态分析是目前研究动物种群亲缘关系及群体遗传多样性的有效途径.本研究针对东乡绿壳蛋鸡保种群体,采用mtDNA控制区的PCR扩增方法,进行多态性检测,并与国内其他9个地方乌鸡品种进行进化分析,以期了解其遗传资源结构,为进一步保护和开发利用提供科学依据.1材料和方法1.1试验样本的选择试验采集的东乡绿壳蛋鸡样本均来自浙江光大种禽业有限公司保种群体G11世代,共39只(公19只、母20只).每只鸡翅静脉采血1.5mL,加入盛有8mL70%乙醇的离心管中,摇匀后置-20℃保存.江山乌骨鸡样本数据来自本课题组［４］,并已被收录于NCBI数据库中.其余8个国内地方乌鸡种样本根据NCBI数据库搜索结果确定,并要求是收录于2011年版《中国畜禽遗传资源志·家禽志》的品种.所有试验样本数据来源见表1.1.2pcr扩增体系1.2.1血基因组DNA提取按照血基因组小量制备试剂盒(Axygen公司)的操作说明提取血样DNA.1.2.2PCR扩增及产物测序引物设计参见文献,上游引物序列:5′-AGGACTACGGCTTGAAAAGC-3′;下游引物序列:5′-ATGTGCCTGACCGAGGAACCAG-3′.PCR扩增体系:DNA模板2μL,上下游引物(10μmol/L)各1μL,10×dNTP1μL,Taq酶0.5μL,最后加ddH２O至50μL.反应程序:94℃预变性3min;94℃变性30s;60.5℃退火40s;72℃延伸40s,35个循环;72℃延伸10min,4℃保存.PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测合格后,送上海英骏生物技术有限公司进行双向测序.1.3序列分析和计算所测DNA序列用DNASTAR5.0软件包进行拼接,用ClustalX1.83进行多重比对剪辑［６］,然后用DNASP5.10软件分析序列多态性、提取单倍型［７］.合并所有10个乌鸡种的序列,用MEGA5.10软件计算品种间进化分歧,并构建单倍型系统发生树[邻接(neighbour-joining,NJ)法,Kimura双参数模型,Bootstrap抽样重复值=1000]［８］.2结果与分析2.1变异位点碱基转换东乡绿壳蛋鸡mtDNA控制区的碱基组成及多态性见表2.本研究获得的39只东乡绿壳蛋鸡mtDNAD-loop序列大小为534bp,包括了高变Ⅰ区和部分保守Ⅱ区,其中变异位点有21个(单一多态位点7个、简约信息位点14个).变异位点碱基发生转换的有15个,占71.4%;发生颠换的有6个,占28.6%.序列的G+C含量为43.1%;核苷酸多样度(Pｉ)平均为0.00829;核苷酸平均差异数(K)为4.42645.获得单倍型9种,单倍型多样度(Hｄ)平均为0.773.从公母性别来看,公鸡的变异位点数、单倍型数、单倍型多样度、核苷酸多样度和核苷酸平均差异数等遗传多态性数值均大于母鸡.2.2单倍型间的遗传距离和组成东乡绿壳蛋鸡mtDNA控制区的单倍型、突变位点及分支归类见表3.21个突变位点位于高变Ⅰ区有10个,占73.3%.9种单倍型中频率最大为DXiang_3(0.410),最小频率为0.026;计算得到单倍型间遗传距离为0.013±0.003.根据Liu等［９］对家鸡分支的划分方法,东乡绿壳蛋鸡单倍型有A、B、C共3个分支类型,其中归于A分支的样本数最多(25个),占总样本数的64.1%;依次为B分支(10个,25.6%)、C分支(4个,10.3%).2.31乌骨鸡与云南省的私家车鸡遗传距离10个乌鸡种的进化分歧估计值见表4.由表4可见,东乡绿壳蛋鸡与同处江西省的泰和丝羽乌骨鸡的分歧值最小,为0.009,表明两者遗传距离最近.湖北省的郧县乌骨鸡与云南省的腾冲雪鸡分歧值最大(0.020);与云南省的盐津乌骨鸡分歧值其次(0.019).江西省的东乡、泰和、余干3种乌鸡之间分歧值小(0.009~0.012).云南腾冲和盐津2种乌鸡之间分歧值大(0.018),同时它们分别与其他各省乌鸡种的分歧值也都大(0.015~0.020).2.41不同品种鸡的国内分支及g/l分析分析10个乌鸡种的248条序列共获得73种单倍型(Hap_1-Hap_73),基于单倍型的系统发生树见图1.由图1可见,10个乌鸡种群体可归为6大分支起源.红色原鸡spadiceus亚种(NCBI参考序列:NC_007235)与单倍型Hap_2归在一起;并与Hap_5、Hap_8、Hap_9等24种单倍型共同构成B分支.Hap_1与Hap_3、Hap_6、Hap_7等13种单倍型共同构成A分支.Hap_4与Hap_13、Hap_14、Hap_15等8种单倍型共同构成C分支(Hap_13单倍型比较偏离C分支,且检测样本数仅1只,在李庆海等［４］文章中的定名是Hap_5,并归为D分支,本研究中将其调整划归为C分支).Hap_11与Hap_16、Hap_20、Hap_25等14种单倍型共同构成E分支.Hap_42与Hap_44、Hap_45、Hap_46等8种单倍型共同构成F分支.Hap_50与Hap_52、Hap_60、Hap_61等6种单倍型共同构成G分支.10个乌鸡种样本数的分支归类见表5.由表5可见,B分支包含的检测个体最多,占31.0%(77/248);A分支其次,占27.8%(69/248).不同品种的分支组成各有偏重,东乡绿壳蛋鸡A分支占优势;江山乌骨鸡和乌蒙乌骨鸡B分支占优势;泰和丝羽乌骨鸡A、B分支占优势;余干乌骨鸡E分支占优势;郧县乌骨鸡C分支占优势;同处云南省的腾冲雪鸡和盐津乌骨鸡均含G分支;而10个乌鸡种中只有腾冲雪鸡含F分支,且占优势.3讨论和结论3.1mtcda变异程度检测本研究测定的东乡绿壳蛋鸡mtDNAD-loop控制区G+C含量为43.1%,低于A+T含量;同时21个突变位点中发生颠换的有6个(6/21),表明该区域内碱基组成具偏倚性,且颠换发生率小于转换发生率,这与黄族豪等［１０］(0/17)、黄道平等［１１］(2/26)、贡潘偏抽等［１２］(3/27)、李辉等［１３］(1/31)、廖承红等［１４］(0/27)和李庆海等［４］(7/30)的研究结果相似.但东乡绿壳蛋鸡在检测区域的后段(450~534bp)出现了6个突变位点,并且其中5个是颠换,这不同于以往的报道,反映出该鸡种的独特性.单倍型间遗传距离、单倍型多样度、核苷酸多样度等是衡量群体mtDNA变异程度的重要指标,距离大、多样度大,则群体多态性高;反之则多态性低.本研究测定的东乡绿壳蛋鸡单倍型间平均遗传距离为0.013;单倍型多样度Hd=0.773;核苷酸多样度Pi=0.00829.通常,遗传距离在0.01以上即被认为mtDNA变异较大,此外,黄族豪等发现泰和乌鸡Hd=0.768、Pi=0.0125;黄道平等发现西畴乌骨鸡Hd=0.884、Pi=0.01452;贡潘偏抽等发现云南瓢鸡Hd=0.883、Pi=0.01503;李辉等发现黔东南小香鸡Hd=0.900、Pi=0.01292;廖承红等发现文昌鸡Hd=0.935、Pi=0.01479.与以往报道相比,东乡绿壳蛋鸡的单倍型多样度、核苷酸多样度等数值并不高,处于中等多态,这是品种固有抑或与样本采自高保种代次有关,还需要进一步验证.3.2品种的地域关联性和亲缘关系包文斌等［１５］研究认为,分布于中国云南西部和西南部、印度支那半岛、缅甸和马来西亚北部的spadiceus亚种(中国红色原鸡)和分布于印度支那半岛、泰国、苏门答腊的gallus亚种(泰国红色原鸡)对中国家鸡的起源均有贡献.本研究参考spadiceus亚种序列(NC_007235),结果发现其同归于10个乌鸡种的B分支,并且,B分支所包含样本数是最多的(77/248),这充分表明国内乌鸡与中国红色原鸡的同源性强.从遗传进化分析结果来看,乌鸡品种之间存在地域关联性,例如,同处江西省的东乡绿壳蛋鸡、泰和丝羽乌骨鸡、余干乌骨鸡地理位置近,分歧值也小;再如,F、G这2个分支仅在同处云南省的腾冲雪鸡和盐津乌骨鸡中存在.另一方面,不同地区的乌鸡品种分支组成各有偏重、遗传距离远近不同,表明乌鸡品种在形成历史上有着各自不同的母系来源和亲缘关系.在