多肽自组装研究进展

多肽自组装研究进展

分子自组现象在自然界非常普遍，在生物进化和生物多样性维护方面发挥着重要作用。这是一个多学科的交叉点。肽类分子自组装材料由于其良好的生物相容性,近年来备受关注。肽分子源于生物体,其基本结构单元是α-氨基酸,在体内可降解,代谢终产物无毒,因此在材料科学、生物医药及临床医学等领域都有广阔的应用前景。1从-交叉至-螺旋的构象转变构成多肽和蛋白质的天然α-氨基酸有20种,除甘氨酸外,其余均为手性分子,L构型,具有相同的基本骨架结构,差别在于α-碳原子上的取代基不同。通过对肽序列的设计以及对肽链的修饰可以实现对多肽自组装的控制,在新材料研究开发中具有重要意义。多肽分子之间可通过非共价键作用自发地形成稳定结构。亲疏水作用、氢键、静电等分子间作用力虽然较弱,但其相互协同仍能形成稳定的高级结构。肽分子之间通过亲水或疏水区域的相互作用可以产生不同的聚集态结构,如胶束、囊泡、纤维和纳米管等。调节亲疏水氨基酸的种类、数量、位置等可以得到不同形态的自组装体。肽分子也可以被疏水性的烷基链修饰形成两亲性分子进行自组装,疏水烷基链之间的相互作用是两亲性肽自组装的主要驱动力,对稳定二级和三级构象起着重要的作用。肽分子之间的静电相互作用也是自组装体形成的重要因素,带电荷的氨基酸残基之间相互作用、介质的离子强度都对自组装产生影响。氢键在肽分子之间很常见,有一定的方向性,肽分子主链上酰胺键以及侧链功能基都易形成氢键,使其具有一定的构型特征,分子间的氢键可以稳定自组装体的构型。多肽分子的常见构象包括α-螺旋、β-折叠、β-转角等,自组装可使多肽分子的构象发生变化。一种16肽Ac-A～D～A～D～A～D～A～D～A～R～A～R～A～R～A～R-NH2(DAR16-Ⅳ)在温度升至70℃以上时,构象由β-折叠不经过无规卷曲状态直接变成稳定的α-螺旋结构,且该过程动力学不可逆。原因可能是温度升高破坏了原本自组装形成的β-折叠结构的水凝胶,而具有电荷取向性的α-螺旋结构对新形成的构象有稳定作用。同理,改变溶液的pH值也能使该肽的构象发生变化。pH值降低,天冬氨酸的侧链羧基质子化,失去分子间的电荷相互作用,也会打破稳定的离子互补型β-折叠结构的自组装体,所形成的α-螺旋结构,即使在低浓度下仍会保持稳定。相反,与DAR16-Ⅳ结构相似的Ac-A～K～A～K～A～K～A～K～A～E～A～E～A～E～A～E-NH2(KAE16-Ⅳ)和Ac-A～E～A～E～A～E～A～E～A～K～A～K～A～K～A～K-NH2(EAK16-Ⅳ)在加热时则不发生从β-折叠至α-螺旋的突变,这可能是由于这两种肽可形成非常稳定的β-折叠自组装体,在加热条件下无法打破,而单一DAR16-Ⅳ形成的自组装体的稳定性则较弱。这种从β-折叠至α-螺旋的构象转变对研究某些神经性疾病的发病机制很有意义。序列稍短的肽Ac-A～E～A～～E～A～E～A～～E～A～K～A～K-NH2(EAK12-d)和氨基酸序列颠倒的Ac-D～A～D～A～D～A～D～A～R～A～R～A～R～A～～R～A-NH2(DAR16-Ⅳ*)也会在某些条件下发生从β-折叠至α-螺旋的构象突变;而序列稍长的肽Ac-A～D～A～D～A～D～～A～D～A～R～A～R～A～R～A～～R～A～D～A～D～A～D～A～D～A～R～A～R～A～R～A～R-NH2(DAR32-Ⅳ)虽具有β-折叠和α-螺旋两种构型,但只能是从HPLC中分离出两种不同构象的肽,不能由一种构象直接转变成为另一种。多肽自组装过程中可能出现不同于初始及最终构象的中间体。Zhang等研究了八肽Ac-FKFEFKFE-NH2(KFE8)自组装的过程中出现的一种左手螺旋条带状的中间体,这种中间体出现在自组装的初期,最终消失。肽刚溶解在水溶液中时,具有典型的β-折叠结构,但随着时间的增加,反平行的β-折叠结构逐渐取代平行的β-折叠结构。他们认为这种中间体的出现是由于肽骨架上氢氧原子不对称分布阻碍了分子间氢键的形成,单螺旋的β-折叠条带不够稳定,两条β-折叠的条带将疏水部分夹在中间,形成左手双螺旋的β-折叠结构,最终自组装成纤维状结构。Caplan等用DLVO理论预测了KFE系列肽在改变氨基酸的疏水性、侧链电荷性质和重复序列对自组装行为的影响以及盐浓度对临界聚集浓度的影响,并用实验进行了验证。Ganesh等研究了CH3(OCH2CH2)3OCH2CO(ILe)3OCH3(A)和CH3(OCH2CH2)3OCH2CO(ILe)3NH(CH2CH2O)3CH3(B)两种被化学修饰的短肽在甲醇中的自组装。两种肽在较低浓度时均为无规和α-螺旋的混合构象,浓度升高时α-螺旋构象比例随之升高。当甲醇浓度逐渐降低时,含有更多极性基团的B比A更易形成构象的转变,β-折叠构象比例急剧增加,其构象为翻转的反平行β-折叠,而A为平行的β-折叠。在凝胶状态时,氢键是自组装过程中的主要驱动力,A形成刚性棒状非交联的结构,而B形成松散、有交联结构、类似淀粉样蛋白的纤维状聚集体。Yamada小组详细研究了疏水烷基链修饰的三肽自组装体的构象。通过调节三肽的氨基酸以及修饰的烷基链的数目、位置和溶剂等因素可形成平行及反平行的β-折叠结构自组装体,并通过将两条方向相反的两亲性肽混合得到反平行的结构。Dublin等报道了多肽TZ1H在pH值高于组氨酸的pKa时,组氨酸去质子化,形成类似异亮氨酸拉链的结构,可形成三股卷曲螺旋构象;在pH值低于组氨酸的pKa时,由于质子化的组氨酸电荷斥力的作用而不能形成三股卷曲螺旋构象。在银离子存在时,通过银离子与组氨酸的相互作用也能诱导肽形成三股卷曲螺旋结构,并随银离子浓度的增加,螺旋构象的比例逐渐增大,且此过程具有可逆性。Przybyla等报道的[ProHypGly]4[ProLys(bipyridyl)Gly][ProHypGly]4肽链是将胶原蛋白中常见序列ProHypGly中的一个羟脯氨酸换成了双吡啶基修饰的赖氨酸,这种肽上的双吡啶基与二价铁离子之间的配位作用可以使三重螺旋结构进一步聚集形成胶原纤维簇。2自主组装的结构多样性2.1肽自组装膜的形成1993年,Zhang等报道了一种16肽Ac-AEAEAKAKAEAEAKAK-NH2(EAK16-Ⅱ)在盐诱导下可自组装形成稳定的膜结构。肽链中疏水的丙氨酸与亲水的谷氨酸和赖氨酸交替排列,谷氨酸和赖氨酸具有电荷互补性,在盐诱导下形成高稳定性的膜,在水溶液中具有典型的β-折叠构象。这种自组装主要是分子间静电相互作用的结果,在水溶液中丙氨酸残基位于一侧,谷氨酸和赖氨酸位于另一侧,肽分子之间交错形成离子键,丙氨酸的侧链通过疏水相互作用咬合在一起,形成稳定的膜结构。这种自组装受外界离子(特别是一价金属离子)的影响很大,这可能是由于一价金属离子的尺寸适合参与膜的形成。肽链的长度也会影响自组装,EAK12可形成少量的膜结构而EAK8则不能形成膜结构。这种自组装膜可以作为一个模型,对于一些由肽自组装所产生的疾病研究有重要意义,比如淀粉样蛋白形成互相缠结的纤维结构引起的Alzheimer症等。EAK16-Ⅱ和另一种肽Ac-RARADADARARADADA-NH2(RAD16-Ⅱ)在水溶液中都具有β-折叠结构,均可通过一价金属离子诱导形成稳定的膜结构。RAD16-Ⅱ也具有与EAK16-Ⅱ相类似的性质,从结构上看,精氨酸与天冬氨酸代替了谷氨酸与赖氨酸,并且电荷顺序也与EAK16-Ⅱ相反。这两种肽自组装形成的膜对于多种哺乳动物的细胞都有较强的吸附作用。Biesalski等研究的一种两亲性肽可以在空气和水的界面上经紫外引发聚合形成单层膜,这种膜在转移到疏水性的云母基底上后,鼠纤维原细胞可在其上吸附并且扩散。一些结构类似于表面活性剂的肽也可以在某种条件下形成膜状的聚集结构。2003年,Yamada小组研究了由烷基链和几个连续亮氨酸组成的两亲性肽的自组装,得到了一种非共价键连接的具有柔韧性的膜。图1a所示的化合物,当n=3时,其CHCl3溶液在基质上通过溶剂挥发可形成上述的膜,而在CCl4中则处于凝胶状态,形成的膜易碎。亮氨酸的疏水性侧链在自组装成膜过程中起着重要的作用,交错的侧链之间的相互作用使得形成的平行β-折叠结构被固定住,如图1b所示。这种膜在高度弯曲的情况下仍然不会断裂,显示出良好的柔韧性,如图1c。2.2表面活性剂类肽在水中的动态光散射作用可自组装形成纳米管或纳米囊的多肽一般是结构类似于表面活性剂的肽。这类肽分子通常含有7—8个氨基酸,和表面活性剂一样有亲水的头部和疏水的尾部。其头部可以是带负电荷的天冬氨酸、谷氨酸,也可以是带正电荷的赖氨酸、组氨酸或精氨酸,尺寸约2.5nm,接近天然的磷酯。这些肽虽然结构序列不同,但有一个共同的特性:头部都含有1—2个亲水性的氨基酸,尾部含有4个以上连续的疏水性氨基酸。表面活性剂类肽头部和尾部的氨基酸可替换为其他天然氨基酸或一些非天然的氨基酸。利用磷酯丝氨酸作为头部,丙氨酸和缬氨酸作为疏水的尾部可以模拟磷酯在水中的自组装,具有不同的临界聚集浓度。与普通脂质体不同,表面活性剂类肽中的疏水性氨基酸侧链通过疏水相互作用以及沿骨架方向的分子间的氢键紧密结合。Zhang研究组以V6D为例对其自组装形成纳米管和纳米囊的可能过程进行了分子模拟。每个肽分子的尺寸为2nm,两个肽分子尾对尾形成的双分子层组成了壳,其最大厚度为4nm。单分子肽形成双层的环,疏水的尾部位于双层结构中间,亲水的头部位于环的外层和内层,接近水分子。经过连续的动态能量最低化,它们成长为单个亚单元环和多重环,环继续通过疏水作用聚集形成长的纳米管,整个过程天冬氨酸一直暴露在水相中,如图2所示。头部为带正电荷的氨基酸的肽,如V6K2,L6K2,A6K,V6H,V6K,H2V6,KV6等,也可在水溶液中自组装形成纳米管和纳米囊结构。当环境的pH值低于肽的等电点时,形成纳米管或纳米囊;而当pH值大于其等电点时,体系形成膜状的聚集结构。这类两亲性肽自组装成的纳米管或纳米囊可以作为不溶性药物和带负电荷的DNA和RNA的载体,在生物医学领域有潜在的应用价值。表面活性剂类肽疏水尾部长度对自组装有一定的影响。研究发现,在中性pH值下,分别含有4,6,8,10个甘氨酸尾部和2个天冬氨酸头部的肽都能在水中自组装形成纳米管或纳米囊,随着甘氨酸长度的增加,动态光散射测得的粒径分布逐渐变宽。Zhang等还研究了乙酰化的A6K和V6D对于光学系统Ⅰ的稳定作用。在A6K存在下,光学系统Ⅰ复合物在室温干态下可以稳定存在3周,V6D对这个体系也有一定的稳定作用,但比A6K弱一些。不同比例的表面活性剂类肽Ac-A6D-OH与Ac-A6K-NH2按一定比例混合,可以通过相互之间的协同作用形成纳米线,进而由整齐的纳米线自组装成膜状结构。除表面活性剂类肽之外,其他结构的多肽分子也能自组装形成纳米管、纳米线或纳米囊等结构。Kanzaki等报道了一种两亲性的嵌段型多肽的自组装,其疏水链段由交替的亮氨酸和2-氨基异丁酸组成,亲水链段由一定数量的肌氨酸组成。这种两亲性肽其疏水链段部分具有α-螺旋构型,可形成纳米管状结构,两种亲水链段长度不同的肽共组装可得到“三叉”型的纳米管。Zhang研究小组最近报道了一种圆锥形肽Ac-GAVILRR-NH2在水溶液中自组装形成的纳米环状结构,肽侧链之间的相互作用导致体系先形成球状胶束,球状胶束经融合或伸长形成纳米管,再进一步弯曲形成纳米环状结构。Park等研究了由两个苯丙氨酸构成的二肽(Phe-Phe)在硅基底上的自组装行为。二肽的1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇溶液在硅片上成膜后,在高温及苯胺蒸气的作用下形成竖直规则排列的纳米线结构(如图3所示),这种新型自组装体具有很好的热稳定性。Biesalski等研究了一种包含可与整联蛋白受体有特殊相互作用的RGD序列,并含有可聚合二炔脂肪链的两亲性肽的自组装。该两亲性肽与未修饰的含有二炔的脂肪酸在溶液中自组装,经过光照引发聚合形成稳定的囊泡。与特定的受体α5β1相互作用后,能产生肉眼可见的颜色变化。Krysmann等发现一种源自淀粉样蛋白β肽的序列KLVFF延长两个丙氨酸形成的肽AAKLVFF,在甲醇中可以自组装形成β-折叠构象的纳米管,苯丙氨酸芳香基团的相互作用在自组装中起主要作用。Lee等将十肽菌素脂化形成的两亲性肽,可以自组装成微米级的管状结构,这种紧密排列的结构可以将酶结合位点保护起来,避免被胰蛋白酶水解,在肽类药物的递送以及一些不稳定的药物前体在特定位置的缓释等方面有潜在应用价值。Bitton等研究了可结合DNA的两亲性肽的二级结构对其聚集行为的影响。该化合物包括三部分结构单元:可结合DNA的GCN4(KDPAALKRARNTEAARRSRARKLQRMKQLE)区域,一个短的卷曲螺旋式的成核序列,可聚合的甲基丙烯酸的烷基尾部。在溶液中,这种两亲性肽形成螺旋状的条带或中空的管状物,结合DNA后形成层状结构,头部的特殊相互作用对自组装体的聚集状态有很大影响。2.3凝胶结构结构多肽最常见的自组装形式是纳米纤维,及由纤维进一步形成的水凝胶结构。这种肽自组装形成的水凝胶通常含水量很高,在生物医学以及组织工程中有很大的应用前景。一些未被修饰的多肽或被疏水烷基链修饰的多肽都可以在某些条件下自组装成纤维或凝胶。2.3.1rad5-自组装体的制备可自组装成纳米纤维并进一步形成水凝胶的肽有特殊的结构特点,一般有亲水面和疏水面两个表面,可以在水溶液中形成稳定的β-折叠结构。疏水面在水溶液中互相靠近屏蔽水分子,亲水面具有排列规则的正负电荷重复序列形成互补的离子键促进其自组装,分子之间还可以形成氢键加固自组装体。由于其亲水面和疏水面就象积木的孔和楔一样,可以排列出不同的结构,因此被形象地称为“肽积木”。由这类肽自组装成的三维纳米纤维支架可用于细胞培养和再生医学的研究,或用于药物、蛋白质及DNA等分子的递送。这类肽带电荷的氨基酸排列顺序可分为以下几种模式:模式1,-+-+-+-+;模式2,--++--++;模式3,---+++;模式4,----++++等。这些分子在水溶液中自组装成纳米纤维结构,并进一步形成由纤维组成的支架材料,孔径约5—200nm,其中一种Ac-RADARADARADARADA-NH2(RAD16-Ⅰ)已经成为商品化的生物支架材料(PuraMatrix)。此类多肽自组装形成的水凝胶含水量非常高,不仅能使细胞存活和移动,还能使生长因子和营养素等缓慢地扩散出入,是可控制细胞分化的理想细胞培养基质和再生医学及药物控制释放的理想材料。“肽积木”型多肽研究较多的主要有RAD系列和EAK系列两类,它们均可以在某些条件下自组装形成纳米纤维和水凝胶。Yokoi等报道了RAD16-Ⅰ在水中自组装形成纳米纤维,具有稳定的β-折叠结构,这些纤维进一步形成含水量大于99.5%的水凝胶。这种自组装体经超声破坏其结构后能够快速地重新自组装,恢复原来的形貌且强度有所增加,该过程重复4次仍然可达到最初的自组装纤维长度。在水溶液中,肽的疏水性丙氨酸位于一侧,而亲水性的带有不同电荷的天冬氨酸和精氨酸位于另一侧,疏水相互作用以及电荷之间的静电相互作用使肽链形成稳定的自组装体。一种滑动扩散模型理论可以用来解释这个过程,如图4所示。由于丙氨酸之间的结合没有特异性,当疏水相互作用被超声破坏后,黏性末端很快能互相接触,进行扩散式的滑动,互补电荷也能迅速地重新结合起来。这种肽自组装成的水凝胶可以作为快速止血材料来使用,将肽溶液涂在伤口上可以在15s内封闭伤口,阻止血液流出,并已经在动物内脏出血的处置中获得了成功。由于该材料止血后不用取出,可以慢慢地被机体降解吸收,在外科手术及急救中具有很好的应用前景。目前,RAD系列多肽自组装形成的水凝胶已显示出作为细胞培养基质的巨大潜力。Holmes等利用RAD16-Ⅰ和Ac-RARADADARARADADA-NH2(RAD16-Ⅱ)两种肽自组装形成的水凝胶支架材料进行神经元细胞的黏附和分化的研究发现,小鼠神经元在此支架上可以形成活跃的树突。Bokhari等研究了RAD16-Ⅰ与高分子材料共同作为细胞外基质对于成骨细胞的增生、分化及矿化的影响。他们发现,RAD16-Ⅰ可以与两种高分散相乳剂聚合物结合,且成骨细胞可以在这种复合材料表面及内部形成多细胞层,RAD16-Ⅰ可促进细胞分化,为细胞生长提供一个自由的环境。Ellis-Behnke等以哺乳动物视觉神经系统为模型研究了RAD16-Ⅰ自组装纳米纤维用于中枢神经系统的伤口修复以及组织再生。RAD16-Ⅰ在仓鼠视束被切断的情况下不仅可以促进伤口部位轴突的再生,也能连接伤口处的脑组织,使仓鼠视觉得到有效的恢复。Genové等研究了功能化的RAD16-Ⅰ自组装形成的水凝胶作为支架材料的一些新的功能。他们将来源于层黏连蛋白Ⅰ中的两个序列(YIGSR,RYVVLPR)以及来源于胶原蛋白Ⅳ中的序列(TAGSCLRKFSTM)作为功能片段插入到RAD16-Ⅰ的氨基端,新的含有功能片段的RAD16-Ⅰ能够自组装成纳米纤维并进一步形成水凝胶。由这些肽形成的支架材料可以形成铺满人体主动脉内皮细胞的单层,促进层黏连蛋白Ⅰ和胶原蛋白Ⅳ的沉积。Wang等将具有功能性的多肽片段与RAD16-Ⅰ相结合得到具有血管再生功能的肽链,并经过自组装形成水凝胶。作为细胞培养支架,与纯RAD16-Ⅰ相比可以显著提高内皮细胞的存活率,促进细胞增殖、移动以及血管的生成。Davis等将RAD16-Ⅱ注射入小鼠的心肌细胞,其自组装形成的纳米纤维作为心肌细胞内的微环境,可以促进血管细胞的聚集。Narmoneva等报道了以RAD16-Ⅱ自组装形成的水凝胶支架作为血管生成的基质,可使人类微血管内皮细胞长时间存活并能形成类似微血管的网状结构。肽自组装支架在没有血管生成因子存在的条件下可以抑制细胞凋亡,并能提高血管内皮细胞生长因子的基因表达,通过改变自组装支架的性质可以控制类似微血管网状结构的形成以及网状结构的尺寸和空间结构。Chau等将对基质金属蛋白酶-2(MMP-2)敏感的六肽底物序列PVGLIG插入到不同长度的(RADA)n序列中,研究了PVGLIG两侧RADA重复序列的长度对肽自组装的影响。他们发现,(RADA)3PVGLIG(RADA)3可以自组装成纳米纤维,并可进一步形成水凝胶,而(RADA)4PVGLIG(RADA)4虽然也可以形成水凝胶,但机械强度低于(RADA)3PVGLIG(RADA)3以及(RADA)4形成的凝胶,因为其在水中的溶解性很小。在MMP-2存在时,(RADA)3PVGLIG(RADA)3形成的水凝胶可以被酶降解。Hong等报道了EAK16-Ⅱ和EAK16-Ⅳ两种肽在不同pH值下形成不同类型的自组装体。在pH值为6.5至7.5时,EAK16-Ⅳ形成球形自组装体而EAK16-Ⅱ形成纤维状自组装体;在pH值低于6.5或高于7.5时,EAK16-Ⅳ自组装体由球形转变为纤维状,而EAK16-Ⅱ自组装体则一直保持纤维状的结构,其原因可能是由于在中性环境中,EAK16-Ⅳ形成了β-转角的构象。全部由D型氨基酸组成的D-EAK16-Ⅱ也可以形成纤维状自组装体并进一步凝胶化,且形成的水凝胶含水量可达到99%。圆二色光谱显示D-EAK16-Ⅱ具有与L-EAK16-Ⅱ近乎对称的类似螺旋构象的图谱。D-EAK16-Ⅱ形成的自组装体可以有效地抵抗体内一些天然蛋白酶的降解作用,可以作为一种很好的组织工程支架来使用。其他类型未经修饰的多肽自组装形成纤维和水凝胶也有诸多报道。Tan小组报道了Ac-RATARAEARATARAEA-NH2(RATEA16)可以自组装形成pH敏感的水凝胶,含水量可达到99.5%。随pH值的变化,RATEA16肽溶液可以观察到溶液-凝胶-沉淀三种可逆的相变过程。这种pH敏感的水凝胶可以结合模型蛋白药物分子胰岛素,并在一定的pH条件下释放出来。Kisiday等研究了Ac-KLDLKLDLKLDL-NH2(KLD12)自组装形成的水凝胶作为软骨细胞外基质以及细胞在水凝胶内的分裂。KLD12也是一种极性与非极性氨基酸交替出现的肽,且极性氨基酸带正负电荷的残基交替排列,类似于EAK和RAD的结构。包封在水凝胶内的软骨细胞经过四周的离体培养,不仅保持原来的形状而且产生了富集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白的类似软骨的细胞外基质。随着培养时间的增加,材料的刚性也随之增加,这种肽自组装形成的水凝胶有望作为软骨细胞的细胞外培养基质在软骨修复中获得应用。最近,Zhou等研究了两种短肽Fmoc-FF和Fmoc-RGD共组装形成的水凝胶。两种肽通过Fmoc基团的π-π堆积形成稳定的β-折叠构象的柱状纤维,纤维之间相互交织形成水凝胶,这种水凝胶可以作为贴壁依赖性细胞的培养支架用于体内的组织再生研究。2.3.2烷基链的两亲性肽自组装体的结构观察肽分子经过化学修饰后,其性质和自组装行为都会受到这些修饰基团的影响。目前,研究最多的是经疏水烷基链修饰的肽,称为两亲性肽。肽链部分可以设计成含有多个生物活性序列的功能区域,使自组装体具有特定的功能。疏水烷基链之间的相互作用是两亲性肽自组装的主要驱动力,可以使两亲性肽自组装成具有高度规则性界面的拟生态的膜,提高稳定二级和三级构象的能力,促进细胞黏附、扩散、移动、增殖及分化。Stupp课题组在烷基链修饰的多肽自组装方面做了大量的工作。2001年,他们利用经过疏水性烷基链以及磷酸修饰的肽自组装成纳米纤维,并用此纤维诱导羟基磷灰石进行生物矿化,成功模拟出类似骨骼中胶原纤维及羟基磷灰石结晶的几何构造关系。这种自组装多肽共分为5个功能区域,可自组装成柱状的胶束。图5a所示的区域1为在肽的尾部引入的长疏水性烷基链,使肽具有两亲性;区域2为4个连续的半胱氨酸序列,由于疏水性的烷基链在胶束的内部,其余部分在胶束的表面,半胱氨酸上的—SH经氧化可形成二硫键,将组装成的胶束结构固定,另外,二硫键的形成是可逆的,可以进行结构上的修正;区域3是三个甘氨酸序列,起到增加亲水性头部柔顺性的作用;区域4是一个磷酸化的丝氨酸残基,用于吸附环境中的钙离子,调节羟基磷灰石的矿化;区域5是具有细胞黏附作用的RGD序列,可使细胞在矿化的结构上生长、分化。实验表明,这种肽自组装形成的纳米纤维,可以诱导羟基磷灰石进行生物矿化,羟基磷灰石的结晶c轴延着纤维长轴生长。两亲性多肽的组成会对自组装结构产生较大影响。对于CCCCGGGS(PO4)RGD序列分别连接0,6,10,16,22个碳的烷基链的两亲性肽自组装研究发现:烷基链碳数目为10以上的样品在浓度为0.25%时,缓慢酸化可以自组装形成水凝胶,但当这些分子用二硫叔糖醇不完全还原或是被I2氧化,酸化则不能形成凝胶,只能得到灰白色的沉淀;10—22个碳烷基链修饰的肽形成的沉淀可观察到浓密的网状纤维;6个碳烷基链修饰的样品只能观察到无规的聚集体;没有烷基链修饰的样品对pH不敏感,而含有6个碳烷基链的样品由于烷基链过短,不能形成组装体。当10—22个碳烷基链修饰的肽被部分氧化形成分子间的二硫键时不能形成凝胶,说明分子间由于二硫键产生的构象变化对自组装有较大的影响。当用丙氨酸替换半胱氨酸后,带有10或16个碳烷基链的肽在浓度达到0.2%或以上时都可以通过酸化形成凝胶,说明半胱氨酸在凝胶的形成中没有特殊作用。但是,含有10个碳烷基链的肽更易形成平行的纤维簇状结构,而含16个碳烷基链的肽则不易出现平行的纤维簇。当均含有16个碳烷基链修饰的下列5种肽序列CCCCGGGS(PO4),C～C～C～C～G～G～G～S(PO4)KGE,C～C～C～C～G～G～G～S(PO4)RGDS,C～C～C～C～G～G～G～S～R～G～D,C～C～C～C～G～G～G～E～I～K～V～A～V无论是否具有细胞黏附作用,还是含有不同的黏附基团,或是否进行磷酸化,都不会影响纳米纤维组装体的形成,只是纤维的长度和强度有所差别。类似的两亲性肽,如alkyl-C4G3S(P)RGD-COOH,可以在多价金属离子诱导下,自组装形成由纳米纤维组成的水凝胶。在含有悬浮细胞的培养液或人造的生理溶液中多价离子诱导下自组装形成的水凝胶,可将细胞包封在水凝胶内,细胞可以在其中继续存活至少三个星期,并可以繁殖增生。C端含有支化的阳离子氨基酸、阴离子氨基酸以及RGDS功能性序列,尾部含有烷基链的两亲性肽与多臂碳纳米管相互作用,在一定的pH值范围内,可以使碳纳米管包封在肽自组装形成的纤维内部,从而增加了碳纳米管在水中的溶解性。肝素可通过两亲性肽头部的LRKKLGKA序列与肝素分子上特定区域的作用结合在自组装纤维的表面,将其原有的β-折叠构象改变为与肝素结合后成为α-螺旋构象。复合物的自组装纤维加入生长因子可促进新血管的形成。含有可促进神经突的生成及生长的功能性头部序列IKVAV的两亲性多肽自组装形成的支架可以使神经元细胞在其上进行分化。IKVAV序列连接1个谷氨酸使之带负电荷,顺序连接4个丙氨酸,3个甘氨酸和1条含有16个碳的烷基链形成两亲性肽。这种两亲性肽在一定条件下自组装形成的水凝胶,可作为三维的细胞培养以及组织再生支架。该两亲性肽在水溶液中自组装成纳米纤维使具有生物活性的部分露置在表层,这些具有很高的长径比以及表面积的纤维束形成三维的网状结构,产生类似于水凝胶的固体。当1wt%的肽溶液与神经祖细胞的悬浮液按1∶1混合时,几秒钟便可形成凝胶状固体,将细胞封闭在其中。该体系可促进神经元细胞快速分化,且具有一定的细胞选择性。带有不同电荷的两亲性肽之间可以通过电荷相互作用进行共组装。Stupp小组研究了16个碳饱和烷基链修饰的含两种相反电荷多肽之间的共组装。含有酸性或碱性氨基酸的肽单独存在时只能在一定的pH值下,中和自身的净电荷后依靠疏水相互作用自组装成柱状的胶束。当两种相反电荷的肽共同存在时,在中性pH值下即可自组装成柱状的胶束,进而形成同时拥有两种功能基的纤维。这种组装形式说明,中性条件下自组装的驱动力主要是静电相互作用,而不是简单的疏水相互作用。两亲性肽形成的β-折叠结构与纤维的长轴平行,从疏水性的核内部放射性的堆积排列,其内部有序程度依赖于分子结构和肽序列。化合物的分子结构和肽序列的变化可以调节自组装形成纤维的物理生物学特性。Behanna等研究了亲水端连接荧光基团的两亲性肽与含互补电荷的不含荧光基团的两亲性肽的共组装,这种共组装体系可以调节纳米纤维组装体表面的荧光强度,生物活性分子(如肝素)可以方便地结合在两亲性肽上,为研究材料与蛋白的相互作用和设计新的生物活性材料提供了理论基础。他们还研究了含有自由N末端的两亲性肽和与其电荷互补的含有自由C末端的两亲性肽的共组装体系。与常规的N末端修饰烷基链不同,C末端烷基修饰的肽末端含有相反电荷的氨基酸序列。当两种带有互补电荷的肽链混合时,可以形成含有稳定的β-折叠结构单一构型的共组装体,而单独存在的情况下则不能形成。这是因为相反电荷相互作用以及烷基链末端的疏水相互作用导致体系可以形成β-折叠的氢键。头部和尾部分别连接亲水性基团而中间被疏水性的间隔臂隔开的两亲性肽分子,也可以在水溶液中自组装成纳米纤维结构。其中心的核部分以及表面都是亲水的,而中间的链段是疏水的,这种自组装体的形成主要依靠氢键作用。Stupp小组还研究了两种两亲性肽在模板上进行的自组装。在超声辅助下,两亲性肽的溶液在含有微通道的基底上自组装形成沿微通道定向排列的纤维簇。这种方法不仅能够形成单轴的排列,也可以通过微通道的引导形成环状的排列,自组装可以通过方向的指引,在宏观尺度上控制材料的性质。Tovar等将色氨酸或芘生色团连接在两亲性肽的头部,通过荧光猝灭实验观察小分子进入自组装纤维的位置,研究自组装体的内部结构。研究表明纳米纤维的内部保持了很好的溶剂化状态,说明其内部有很高程度的自由体积。纤维内部的生色团可与外部环境中的小分子不同程度地相互作用,说明小分子可以自由进入纤维内部,这种自组装的纤维有可能成为药物递送的载体。Li等研究了两亲性肽自组装纤维作为模板诱导金纳米粒子的定向自组装。图6所示的两种两亲性肽在非极性溶剂中进行自组装,其中PA2修饰上胸腺嘧啶,自组装形成的纳米纤维表面的胸腺嘧啶功能基可与2-氨基吡啶修饰的金纳米粒子相互作用,使金纳米粒子产生定向排列。这种排列主要依靠胸腺嘧啶与2-氨基吡啶之间的碱基对识别作用。他们还报道了两端都被烷基链修饰的两亲性肽变换端基的结构,可形成直的纤维或左手螺旋结构。末端取代基体积的增大使形成的纤维发生扭曲形成螺旋结构,并随着端基体积的继续增大,形成的螺旋结构自组装体的螺距随之减小,最小减至22nm的极限值,这可能是由于体系需要保持氢键作用的原因。更有趣的是,当端基为光敏感的基团时,在紫外光使其构型由反式变为顺式时,所形成的螺旋式的自组装体变得更加紧密,螺距由78nm变为56nm。这些现象说明空间位阻效应在自组装过程中起着重要的作用。Cui等报道了一种两亲性肽(C16H31OVEVE)自组装形成的具有β-折叠构象完全平坦的巨大纳米条带状结构,降低浓度可以发现平坦的条带由扭曲的条带组成。当pH值改变时,可使平坦的条带表面产生规则排列的凹槽。近来,研究者们将电子特性引入到两亲性多肽中,使电子特性与生物活性相结合,为探索新的多功能材料提供了新思路。2008年,Stupp小组研究了将含有丁二炔的烷基链共价连接到肽尾部后形成的两亲性肽的自组装行为。他们发现,这种结构的两亲性肽可以自组装成柱状纤维,并可以在某些条件下形成水凝胶。疏水性的烷基链在纤维的内部,经过紫外光照射可以形成聚丁二炔,这种双键与三键交替出现的共轭体系具有特殊的电学特性,在外观上显示出规则排列的π-体系特有的蓝色。在溶液中或形成凝胶的状态下,两亲性的肽均处于一种有序的排列状态,自组装成的柱状纤维在聚合后可以保持聚合前的纤维状结构。无论聚合前后,支化的肽都比线性的肽聚合程度低,因为支化的肽在自组装时纤维内部疏水性烷基链的密集程度不如线性肽。2009年,Mata等发现含有RGDS功能序列的这类两亲性肽自组装体可通过二炔的聚合得到具有生物活性的微米尺度的水凝胶,这类具有显微结构的水凝胶可用于成骨细胞的培养。Hartgerink课题组研究了含有酶作用位点的两亲性肽自组装的纳米纤维在酶作用下的降解。两亲性肽包括细胞介导的酶敏感部位(GTAGLIGQ),C端可结合钙离子的羧酸以及细胞黏附配体RGDS。由于肽序列中含有特殊的基质金属蛋白酶切割位点,使细胞可以介导纤维的蛋白质分解,从而获得移动的通道。这种两亲性肽可以在钙离子的诱导下,在生理条件下自组装成由网状纳米纤维组成的水凝胶,将细胞包封在内。细胞产生的酶可使水凝胶发生降解,使细胞获得空间进行扩散和移动。进一步研究发现,一系列支化的头部含有细胞黏附功能序列RGDS,尾部连接十六酸的两亲性肽均可在生理溶液或其他相关溶液(如滑液或DNA等)存在下自组装形成纳米纤维,并进一步形成水凝胶。对肽链中的色氨酸进行荧光各向异性的检测发现,与线性两亲性肽相比,支化的化合物上的色氨酸具有一定的移动空间。支化的头部含有RGDS功能片段的两亲性肽自组装成的纤维在细胞黏附以及扩散等方面都优于线性的两亲性肽,这是由于支化的化合物自组装体的表面可以提供更多的可黏附细胞的活性位点,并在空间上不是特别紧密堆积,使得体系具有一定的移动空间,利于细胞的接近。这些支化的两亲性肽还可以在PGA组织支架上进行自组装,并在细胞培养环境中可保留在PGA支架上,RGDS功能肽片段位于支架表面。研究表明,相对于线性两亲性肽覆盖的支架和没有两亲性肽覆盖的支架而言,人类的膀胱平滑肌细胞优先选择黏附在有支化两亲性肽自组装纤维覆盖的区域,这个体系为膀胱组织的再生提供了理论上的可能。2.4两亲性肽在脂质体及细胞中的协同作用Ramani等研究了聚(L-组氨酸)与十二烷基苯磺酸复合物的自组装。按化学计量的多肽与表面活性剂形成的自组装体为层状结构,具有PolyproⅡ型的左手螺旋结构。这种复合物形成的自组装体具有明确的玻璃化转变温度(Tg),当自组装体升温至Tg以上再冷却至原温度后,原层状结构中含有磺酸基与肽的酰胺基之间形成的氢键作用消失,体系重新排列形成更加有序的结构。Sureshbabu等研究了淀粉样蛋白β-肽在十二烷基磺酸钠作用下形成的球状聚集体结构,从而推测了Aβ1—42与细胞膜中的磷脂相互作用后构象发生改变的机制。Imanishi等研究了多肽与磷脂之间的共组装形成的双层膜结构,疏水的具有α-螺旋构型的多肽在磷脂双层膜中以螺旋轴垂直于双层膜表面的形式存在。Paramonov等报道了两亲性肽可以与磷脂分子共组装形成纤维状结构,当磷脂分子的含量(mol%)达到5%时,所形成凝胶的储能模量达到最大值,同时平均残基椭圆率也达到最大值。随着磷脂分子含量的增加,两个值都急剧下降,虽然两者的混合物在磷脂分子含量达到75%时仍能观察到纳米纤维状自组装体结构,但含量达到20%时,就已不能形成水凝胶。当其含量为5%时,恰好形成了最为稳定的β-折叠结构,这说明,磷脂分子参与了自组装,且增加磷脂分子的含量会破坏β-折叠结构,使形成的水凝胶储能模量下降。这种自组装形成的水凝胶是依靠疏水相互作用以及氢键作用,当破坏了氢键作用,水凝胶的机械强度就随之减弱。两亲性肽在脂质体内部通过光引发也能自组装形成纳米纤维,这种体系有可能将具有生物活性的肽靶向递送到特殊的组织。Yuwono等研究了末端疏水烷基链修饰的两亲性肽催化的二氧化硅纳米管的形成。两亲性肽自组装形成纳米纤维,并可以诱导四乙氧基硅烷矿化,形成以肽纳米纤维为核,四乙氧基硅烷为壳的复合纳米纤维。经过焙烧除去肽后,可形成中空的二氧化硅纳米管,这种方法有望扩展到其他纳米材料的制备中。3影响多媒体自组装的因素3.1两亲性肽自组装体pH值或离子强度的改变可以使多肽上的氨基酸侧链的电荷性质发生变化,从而对其自组装行为产生影响[11,12,13,14,27,29,59,73,86,87,88]。Schneider等报道了一种肽VKVKVKVKVDPPTKVKVKVKV-NH2(MAX1)的自组装行为对溶液pH值的依赖。肽链主要由具有高度β-折叠倾向的缬氨酸和赖氨酸组成,在碱性条件下肽链9—12位的VDPPT序列采取Ⅱ′型的翻转构象,亲水性的赖氨酸和疏水性的缬氨酸交替排列,整个分子具有β-发夹结构,这种分子内的折叠结构可以促进分子间自组装形成水凝胶;在酸性条件下,由于赖氨酸残基上的氨基被质子化而带电荷,分子间的静电斥力使这种折叠结构被破坏,不能自组装成水凝胶。这类水凝胶可用于包封模型药物分子,通过调节多肽的浓度或对肽序列进行调整可改变凝胶的孔径,进而调节药物分子的释放速度。Guler等将模型分子芘共价连接在两亲性肽的疏水链端,在pH=4时化合物呈现无规卷曲的状态,当pH=10时,含亮氨酸的两亲性肽自组装形成纳米纤维,将芘分子包封在纤维内部,芘分子规则排列。如果将亮氨酸替换成了脯氨酸,由于失去了分子间氢键的作用,不能自组装成柱状纤维,只能形成球形胶束,芘分子排列与pH=4时相同。将RGDS肽序列连接在亲水端,将胆固醇或十六酸连接在疏水端,这些两亲性肽与芘混合后都可以自组装成纳米纤维,芘则被包封在纤维内部。这个体系有成为新的疏水性药物靶向递送载体的可能。支链含有胸腺嘧啶肽核酸的两亲性肽(KK(K～T～T～T～T～T～T～T～K)G～G～G～A～A～A(K)OCC15H31)也能在不同pH值下表现出不同的自组装行为。当pH=4时,肽核酸/两亲性肽溶于水;当pH=7时,体系变成由网状自组装纤维组成的凝胶态。带有胸腺嘧啶的肽核酸与两亲性肽形成的缀合物可自组装成纳米纤维,其中肽核酸部分与互补的寡聚核苷酸结合,其结合力比相应没有形成缀合物的肽核酸更强。这种自组装形成的材料可用于RNA干扰研究,以及mRNA分离和纯化等领域。他们还将支化的两亲性肽和线性的两亲性肽用生物素进行修饰,研究了它们自组装形成的纳米纤维与亲合素之间的相互作用。与线性的两亲性肽形成的纤维相比,支化的两亲性肽形成的纤维由于空间效应,排列不够紧密,提供了更多的表位用来结合亲合素受体。Pires等报道了一种N端和C端分别被氮基三乙酸和两个组氨酸修饰的,具有胶原三股螺旋结构的肽在金属离子诱导下形成的球状自组装体。在二价金属离子存在下,多肽通过与金属离子之间的配位作用形成微米级的聚集态结构,在金属离子螯合剂EDTA存在时,该自组装过程可逆。3.2kvkv-nh2可以温度对多肽自组装体的形成以及自组装类型的改变起着重要的作用。一般来说,温度升高将破坏体系中的氢键,使自组装体的构象发生变化,从而影响自组装体的稳定性。Schneider等报道了MAX1和将MAX1的7,16位上的缬氨基替换成苏氨酸的两种肽VKVKVKVKVDPPTKVKTKVKV-NH2(MAX2),VKVKVKTKVDPPTKVKTKVKV-NH2(MAX3)自组装形成温敏性的水凝胶。其中MAX3序列在温度由5℃升至80℃时,分子内先发生折叠,然后自组装成水凝胶,温度降至5℃时又变成非折叠的状态,过程可逆。当7位和16位上的苏氨酸替换成疏水性更强的缬氨酸后,凝胶化的温度升高。当用L-脯氨酸替换10位的D-脯氨酸后,由于不能形成β-转角构象,在相同条件下不能凝胶化。MAX2和MAX1虽然可以凝胶化,但与MAX3相比凝胶化的过程没有可逆性。Yu等设计了含有胶原模型肽序列头部和双烷基链尾部的两亲性肽,这种肽在水中可自组装成类似于PolyproⅡ型的三股螺旋结构。氢键作用是三股螺旋结构组装体形成的主要原因,因此自组装受温度的影响很大,当以疏水烷基链修饰后,烷基链的疏水相互作用可以大大提高自组装体的稳定性。对于(Gly-Pro-Hyp)4-[IV-H1]-(Gl