超高效液相色谱法快速鉴别控制技术在普洱茶奶茶中的应用

超高效液相色谱法快速鉴别控制技术在普洱茶奶茶中的应用

茶是中国传统的健康饮料，也是世界上受欢迎的饮料。茶汤滋味是形成茶叶风味特征的重要指标之一,同时也是决定茶叶价值的重要指标之一,更是影响茶饮消费者消费的重要因素之一。其中,茶多酚给茶汤带来醇和、收敛性较强的味感。而且有研究表明,茶多酚具有其它植物难以比拟的抗氧化能力,清除体内自由基、抗癌防癌、降血脂等,还具有纯天然、高效能、无毒副作用等显著特点。咖啡喊给茶汤带来一种适合的苦味。茶中20余种游离氨基酸对茶叶滋味也有一定影响。人们达成共识,茶汤滋味是由茶汤中的各滋味化合物共同作用产生的一种效果。目前,茶产品相关企业主要是凭借技术人员的经验来进行原材料质量控制和新产品设计开发,急切需要建立快速、系统研究茶汤滋味的仪器分析方法和数据分析方法。超高效液相色谱(UPLC)技术是近年来发展较快的新型液相色谱检测技术,更有利于提高流动相流速、缩短分析时间和提高分析通量。相对于传统高效液相色谱(HPLC)A而言,UPLC具有更好的分离效率、峰容量以及灵敏度,而关于茶叶多酚的超高效液相色谱法-质谱法(UPLC-MS)的分析方法中UPLC采用的流动相体系中多酚化合物仅达到部分分离,同一保留时间下以质谱信号进行定量区分。但MS-MS仪器比较昂贵,因此,需要精进相对低成本UPLC方法为茶叶相关研究提供良好的技术平台。主成分分析能够进行数据将维、变量提取与压缩、确定化学组分数、分类和聚类以及与其他方法联用进行数据处理。已经成功应用于道地山药和中药贝母的鉴别。在茶叶研究方面,主要在茶叶香气的鉴别和少量滋味鉴别,但以上分析方法一般为定性半定量的,而应用于茶叶滋味的定性定量鉴别方面尚未见报道。本文建立快速、同时测定乌龙茶茶汤中儿茶素和咖啡因等主要滋味化合物的超高效液相色谱新方法,并辅以光谱法分析总多酚化合物含量,总氨基酸含量和总蛋白含量结合传统滋味感官评价,以乌龙茶茶汤中的15个共有成分为分析变量,运用主成分分析对来自10种不同等级和种类的茶汤滋味样品进行鉴别研究。为未来茶叶原材料的品质控制提供理论数据和技术保障,同时为产品开发提供新思路。1材料和方法1.1u3000存在的标准溶液及试剂福林酚美国sigma公司;没食子酸和无水碳酸钠(均为分析纯)天津北方天医化学试剂厂。乌龙茶:宋种、柚花香、遍天香、白叶、黄枝香单枞、芝兰香单枞、杉林溪高山乌龙、铁观音(大宗1)、乌龙(大宗)、铁观音(大宗2)(10支)市售(以上茶叶原料经相关专业茶学专家进行鉴定)。0.2mol/L福林酚试剂:将2N福林酚试剂稀释10倍;碳酸钠溶液:2g无水碳酸钠溶于100mL0.2mol/L氢氧化钠溶液;20μg/mL没食酸:准确称取0.0100g溶于50mL水中,作为工作液(1mL含没食子酸0.2mg);茚三酮溶液配制:称取水合茚三酮(纯度不低于99%)2g,加50mL水合80mg氯化亚锡(SnCl2·2H2O)搅拌均匀,放在暗处,静置12h,过滤后加水定容至100mL;茶氨酸标准溶液的配制:准确称取100mg茶氨酸(纯度不低于99%)溶于10mL水中,作为母液,准确吸取5mL母液,加水定容至50mL,作为工作液(1mL含茶氨酸0.1mg);碱性硫酸铜溶液:(1)含2%Na2CO3的0.10mol/LNaOH。(2)含0.5%CuSO4·5H2O的1%酒石酸钠或酒石酸钾。试剂(1)与试剂(2)以体积比50∶1混合,1天内使用;1mol/L福林酚试剂:将2mol/L福林酚试剂稀释2倍;牛血清蛋白标准溶液(1mg/mL)的配制:称取1克牛血清蛋白溶于0.9%氯化钠溶液,定容至1000mL;UPLC系统的标准溶液的配制:分别准确称量适量的咖啡因、没食子酸及8种儿茶素标准品(精确至0.1mg),用超纯水配制成含茶没食子酸(GQA)(1683mg/L)、可可碱(TB)(1685mg/L)、没食子儿茶素(GC)(1800mg/L)、表没食子儿茶素(EGC)(1666mg/L)、儿茶素(C)(960mg/L)、咖啡因(CF)(1780mg/L)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)(1700mg/L)、表儿茶素(EC)(1666mg/L)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)(1700mg/L)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)(1683mg/L)、儿茶素没食子酸酯(CG)(1666mg/L)的储备液。未知Unknown化合物纯度98%以上已经采用制备色谱分离纯化得到,结构鉴定和命名正在进行中。将标准储备液配制成混合标准溶液后,再用起始流动相稀释10、20、30、40和50倍的系列混合标准溶液。1.2设备和设备液相色谱仪1290美国Agilent公司;分析天平美国梅特勒公司;数显电热恒温水浴锅EMS-30天津市欧诺仪器仪表有限公司。1.3注满登记,约5mol,称取样茶2g,投入审评杯中,茶水比1∶50,约150mL,注满沸水,加盖计时5min。将杯内茶汤滤入审评碗内,留叶于杯中。审评碗中的茶汤过滤,留样待检测。1.4色谱条件及标准品采用超高效液相色谱二极管阵列UV-VIS检测器测定茶汤中的儿茶素、咖啡因。色谱柱:AgilentZobraxEclipeplusC18RidResolutionHT(2.1×50mm,1.8Micron)流动相:A甲醇;B水(含1‰甲酸-3%乙腈);梯度曲线见表1;柱温:30℃;进样量:2μL;二极管阵列UV-VIS检测器(DAD)检测波长:278nm,254nm,210nm,360nm,以278nm处测得的峰面积进行分析,其它波长用于观察杂质。样品测定采用色谱峰面积的保留时间定性,采用外标法以峰面积定量。图1为茶叶滋味标准品混合物的色谱图。在6min内茶叶滋味标准品达到了理想的色谱分离效果。样品平行测样三次。1.5酚类化合物含量测定茶汤中总茶多酚的测定在GB/T8313-2008《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》第二法的基础上进行修改,采用酶标仪进行测定。将茶汤样品稀释5倍后分别取20μL加入96孔板中,加入100μL0.2mol/L福林酚,振荡,加入80μL碳酸钠溶液,振荡混合,在765nm处测量反应混合物的吸光度,每样重复测定三次。茶汤中酚类化合物含量以每克茶叶浸泡液中含有没食子酸的毫克数表示。以没食子酸为标准品,测定标准曲线。没食子酸线性范围为(0-20μg/mL),线性回归方程为:y=0.0064x+0.0249(R2=0.9989)。1.6标准曲线的测定茶汤中游离氨基酸总量的测定是在GB/T8314-2002的基础上修改的,采用酶标仪进行测定。茶汤稀释5倍,取样1mL待测液,加0.5mLpH8.0的磷酸盐缓冲液,加入0.5mL2%的茚三酮溶液,沸水浴加热10min,冷却至室温,定容至25mL。在570nm处,采用酶标仪测定吸光度,每样重复测定三次。以茶氨酸作为标准品,测定标准曲线。茶氨酸线性范围为:(0-400μg/mL),线性回归方程为:y=1.0151x+0.0292(R2=0.9985)。1.7标准曲线的测定茶汤中可溶性蛋白总含量的测定是在文献的基础上修改的,采用酶标仪进行测定。茶汤适当稀释后,分别取30μL加入96孔板,迅速加入碱性硫酸铜溶液150μL,并振荡混匀,静置10min,然后加入15μL的1mol/L福林酚试剂,迅速振荡混匀,室温放置30min。在500nm处,采用酶标仪测定吸光度,每样重复测定三次。以牛血清白蛋白作为标准品,测定标准曲线。牛血清白蛋白的线性范围为(0-100μg/mL),线性回归方程为:y=1.0123x+0.0974(R2=0.9989)。1.8茶汤的感官评价标准待品评的茶叶:乌龙茶(10支)。品评人员:专业茶叶感官品评小组4-5人。依据GB/T23776-2009《茶叶感官审评方法》滋味审评因子的审评要素:茶汤的滋味有浓淡、厚薄、甘甜、苦涩、鲜、酸等。一般茶汤滋味以口感醇厚甘甜为好;而平淡乏味或含有粗涩异味者为次。审评顺序:开汤后,按香气(热嗅)、汤色、香气(温嗅)、滋味、香气(冷嗅)的顺序逐项审评。尝滋味:用茶匙从审评碗中取一浅匙吮入口中,茶汤入口在舌头上循环滚动,使茶汤与舌头各部位充分接触,并感受刺激,随后将茶汤吐入茶桶或咽下:茶汤温度一般在50℃左右较符合评味要求。具体茶叶审评评分标准见表2。1.9处理数据试验数据采用spss16.0进行分析。感官评价分数采用Turkey检验进行分析。主成分分析采用XLStat7.5进行分析。2结果与讨论2.1香或香法作品,作丙档乌龙茶的传统滋味评价评分标准件表结果分别见表3。评价结果显示宋种和柚花香的滋味评分属于甲档;杉林溪高山乌龙、遍天香、白叶和芝兰香单枞的滋味评分属于乙档;铁观音(大宗1)、铁观音(大宗2)、乌龙茶(大宗)和黄枝香单枞滋味评分属于丙档;乌龙茶室温保藏即可,滋味不易发生变化。2.2线性方程和检出限由紫外全扫描图2可知,茶汤最大吸收波长分别在205nm和278nm,而205nm处检测干基质干扰大,因此选定278nm为UPLC的测定波长。为了加快研究进度并发现更多含量低的滋味化合物,使用采用了1.8μm颗粒度的色谱柱填料技术超高效液相色谱,大大提高了色谱柱性能的超高效液相色谱。本研究考察了AgilentZobraxEclipeplusC18RidResolutionHT(2.1×50mm,1.8Micron)对于茶汤多酚化合物的分离效果。不同的流动相溶剂经常呈现出显著的分离选择性和洗脱强度差异,分别对甲醇-水、乙腈-水、甲醇-水(0.1‰甲酸)、乙腈-水(0.1‰甲酸)和甲醇-水(1‰甲酸-3%乙腈)流动相进行了考察。结果表明,采用甲醇-水(0.1‰甲酸-3%乙腈)作为流动相更有利于滋味化合物的色谱分离。由于茶叶多酚化合物的结构十分类似,等度洗脱条件下难以实现同时分离。采用梯度洗脱的方法,经过梯度洗脱条件优化,7min内即完成了11种化合物(8种儿茶素、咖啡因及茶没食子酸)的分离检测。此外,由于检测限提高,从茶汤样品中检测到了未见报道的化合物。纯化并鉴定分析化合物的结构本文不予讨论。试验结果表明,流动相的酸度对茶叶多酚化合物的色谱分离影响不大。典型的茶汤色谱图见图3所示:在UPLC系统上,茶没食子酸(GQA)、没食子儿茶素(GC)、可可碱(TB)、表没食子儿茶素(EGC)、咖啡因(CF)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素(EC)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)、未命名化合物、表儿茶素没食子酸酯(ECG)和儿茶素没食子酸酯(CG)在1-10ng/L范围内与其各自对应的峰面积呈线性关系,相关系数都大于0.9990;儿茶素(C)在0.5-5ng/L范围内与其各自对应的峰面积呈线性关系,相关系数R2=0.9998。得到多酚化合物的线性方程和最低检出限(以S/N=3计)。结果分别见表4。超高效液相色谱分析乌龙茶茶汤中的儿茶素、咖啡因等和光谱法分析茶汤中的多酚、可溶性蛋白、游离氨基酸的含量见表5。结合感官评价结果和文献报道:推测乌龙茶中滋味贡献比较大的化合物为茶没食子酸(1)、可可碱(2)、表没食子儿茶素(3)儿茶素(4)、表没食子儿茶素没食子酸酯(6)、表儿茶素(7)、没食子儿茶素没食子酸酯(8)、未命名化合物(9)和表儿茶素没食子酸酯(10)及多酚、可溶性蛋白和游离氨基酸。2.4不同途径最佳可溶出率的结果—主成分分析乌龙茶茶汤滋味采用主成分分析来判断哪些滋味化合物可能有利于构成乌龙茶特色滋味(表5,图4)。在主成分分析中,前两个主成分解释来自10支大宗乌龙茶滋味相关化合物86.44%的总变异,说明前三个主分F1-F2-F3构成的空间足够解释构成乌龙茶特色滋味化合物。F1能够说明48.76%的差异,F2能够说明21.17%的差异,而F3能够说明16.51%的差异。首先,从因子负荷量表(表6)和主成分分析二维图(图4)可以观察到滋味变量和儿茶素等化合物总和具有正相关性,表明乌龙茶茶汤中儿茶素等化合物在冲泡过程中较易溶出且对滋味贡献比较大。根据UPLC分析的出峰顺序将分析出的滋味化合物编号分组。主成分分析图4可以解释76.99%的变异。F1上方,F2轴附近区域变量可溶性蛋白(PR)、游离氨基酸(AM)和可可碱(2)有益于构成乌龙茶特色滋味,因为这些变量与“滋味”变量正相关(F2>0.6)。F2右侧,F1轴附近区域变量茶没食子酸(1)、儿茶素(4)、表没食子儿茶素没食子儿茶素(6)、未命名化合物(9)、表儿茶素没食子酸酯(10)和多酚(PO)冲泡过程中易于溶出,而且变量本身具有一定的滋味,因为这些变量与“儿茶素和咖啡因的等的总和”有显著正相关(F1>0.7),而与“滋味”变量也有部分的正相关性。推测可能构成茶汤滋味的第一类本底味;F1轴附近,F2轴左侧变量表没食子儿茶素(3)和表儿茶素(7)冲泡过程中不易溶出因为与“儿茶素和咖啡因等的总和”具有负相关性;且与滋味变量具有的负相关性,推测可能构成茶汤滋味的第二类本底味;F1轴下方F2轴附近,咖啡因(5)因为其冲泡过程中有一定的溶出率,但与滋味变量具有的负相关性,推测可能构成茶汤滋味的第三类本底味。综合以上分析结果推测:可溶性蛋白(PR)、游离氨基酸(AM)和可可碱(2)可能为乌龙茶特色滋味化合物,因为其冲泡过程中溶出率低但滋味相关性高。茶没食子酸(1)、儿茶素(4)、表没食子儿茶素没食子