hplc法测定茶叶中表没食子儿茶素没食子酸酯和咖啡因

hplc法测定茶叶中表没食子儿茶素没食子酸酯和咖啡因

茶叶是中华民族的传统保健饮料，历史悠久，在人们的生活中发挥着重要作用。作为一种天然产物,茶叶产地众多,而且加工又各有差异,使得茶叶的质量评价始终难以统一,目前主要以色、香、味等主观的感觉为指标进行评判。茶多酚是茶叶的重要组成部分,是一种高效低毒的自由基清除剂,主要含儿茶素类成分,其中表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是茶多酚的主要有效成分之一,具有抗氧化、抗肿瘤、抗衰老等广泛而确切的作用。咖啡碱(Cafeine,CAF)是茶叶中含量最高的含氮化合物,具有兴奋精神、解除疲劳、止渴生津、散热镇痛等作用,是重要的医用原料和食品添加剂,但由于CAF具有较强的中枢兴奋作用,其含量往往受到控制。因此,以EGCG和CAF为指标对茶叶进行质量评价有一定的意义。目前,茶叶中EGCG和CAF的含量测定主要采用的是HPLC法,但均有不尽人意之处,如采用梯度洗脱,分析时间较长;儿茶素类成分易氧化,测定方法不稳定等。本文采用等度洗脱,茶叶中的表没食子儿茶素没食子酸酯和咖啡因在20min内得到理想分离,并对其中的EGCG和CAF进行了含量测定,以期为茶叶的质量评价提供实验依据和参考。1实验材料1.1药品、化学品和仪器Agilent1200高效液相色谱仪(UV检测器),1810D自动双重纯水蒸馏器,SartoriusCP225D电子天平,DSY-1-2恒温水浴锅;EGCG对照品,(上海融禾医药科技发展有限公司,批号为050119,纯度>98%);CAF对照品(中国药品生物制药品检定所,批号100101-198403);茶叶样品(由福建省永春县林业局提供);焦亚硫酸钠;乙二胺四乙酸(EDTA);甲醇(HPLC试剂,SKChemicalsUlsan680-160,Koroa);水(自制重蒸馏水);甲酸(分析纯)。1.2流动相、柱温色谱柱:HypersilODSC18(4.0mm×250mm×5μm);流动相为甲醇-0.1%甲酸(30∶70);流速为0.5ml/min;柱温为25℃;检测波长为278nm。1.3溶液的制备1.3.1混合对照品溶液精密称取干燥后的EGCG、CAF对照品及焦亚硫酸钠、EDTA适量,用含0.1%甲酸的水溶解后定容,得到EGCG浓度为1254μg/ml、CAF浓度为244μg/ml的混合对照品溶液,并含0.1%焦亚硫酸钠和0.01%的EDTA。1.3.2浸提液的制备将茶叶样品适当粉碎,干燥后精密称取约5g于烧杯中,加入10倍量的水,95℃水浴浸提1h,冷却至室温,过滤。滤渣同上法再提取1次,并用少量水洗涤烧杯和样品残渣,合并滤液,定容至100ml的量瓶中。精密吸取1ml,用水定容于5ml的棕色量瓶中,即得供试品溶液。用0.45μm微孔滤膜过滤后进样。2方法和结果2.1标准曲线的绘制精密吸取混合对照品溶液0.5、0.6、0.8、1.2、2.0ml,用含0.1%甲酸的水定容至2ml量瓶中,摇匀,按“1.2”项下的色谱条件进样分析结果(图1)。并分别以各组分的浓度(C)对峰面积(A)绘制标准曲线,得到EGCG线性方程A=42.6C-13067(r=0.9995),CAF线性方程A=95.3C+103.8(r=0.9994)。结果表明,EGCG检测浓度的线性范围为313.5～1254μg/ml,CAF检测浓度的线性范围为61～244μg/ml。2.2溶液进样测定精密吸取浓度为376.2μg/ml的EGCG、浓度为73.210μg/ml的CAF混合对照品溶液连续进样5次,每次20μl,用“1.2”项下色谱条件分析,峰面积的RSD分别为1.15%和0.57%。结果表明,本方法精密度良好。2.3进样量与进样量取新制备的铁观音(秋茶)样品溶液,每隔一定时间进样分析1次,进样量为20μl。结果表明,样品溶液在制备好后的20h内,EGCG和CAF的峰面积的RSD分别为1.99%和1.29%,说明样品中的测定组分在20h内稳定,可以进行含量测定。2.4加样样品中ecgg和caf含量的测定取铁观音末(秋茶)样品,按“1.3.2”项下方法平行制备5份样品溶液,进样20μl。依据所得峰面积值可获得EGCG和CAF在茶叶样品中的含量,EGCG平均含量为6.68%,CAF平均含量为1.76%,其RSD分别为2.12%和0.64%。结果表明,本法重复性较好。2.5加样回收和精密度精密称取已知含量的铁观音末(春茶)约2.5g,按“1.3.2”项下方法平行制备5份样品溶液,加入适量对照品、焦亚硫酸钠和EDTA,用水定容,摇匀。各样品溶液用0.45μm的微孔滤膜过滤后进样,进样量20μl,结果表明(表1,表2)EGCG平均回收率101.96%,RSD为2.72%;CAF平均回收率为104.97%,RSD为0.87%。2.6色谱条件进样分析各茶叶样品按“1.3.2”项下方法平行制备3份样品溶液,用“1.2”项下的色谱条件进样分析,进样量为20μl。将获得的各组分峰面积值代入相应的回归方程中,求取各样品溶液的浓度,计算各组分在茶叶样品中的含量(表3)。3加合物的氧化反应在线性考察过程中,发现EGCG存在转化或者被氧化的现象。EGCG是二十二联苯酚基苯并吡喃与没食子酸形成的酯,具有酚类抗氧化剂的通性,因此很容易被氧化或发生转化。为了防止EGCG的氧化或发生转化而影响测定结果,在配制对照品溶液时,加入了适量的抗氧剂焦亚硫酸钠和金属络合剂EDTA以消除氧化作用和微量金属离子对自动氧化反应的催化作用。实验结果表明,加入适量的焦亚硫酸钠和EDTA,不影响样品的测定结果,同时增加了测定方法的稳定性。在所收集的茶叶样品中,检测到铁观音中EGCG和C