盐酸胍诱导的蛋白质变性特征的吸附反应动力学研究

盐酸胍诱导的蛋白质变性特征的吸附反应动力学研究

在现代生物化学和生物化学领域，蛋白质的折叠问题是一个非常感兴趣的研究问题。蛋白质分子在行使生物功能时需要特定的三维结构。蛋白质折叠问题是如何形成蛋白质的自然结构，即。在一定的氨基酸序列中，多酚链是如何形成蛋白质的独特结构。蛋白质相对容易受到外部因素（温度、变性剂等）的影响，容易发生构象变化，导致活性丧失和物理性质异常变化。在这个过程中，这个过程被称为蛋白质变形。根据1931年的大量实验工作，吴仙在20世纪20年代首次提出了蛋白质变形的概念。蛋白质变形不是由其化学结构的变化引起的，而是由空间结构的变化引起的。吴仙的蛋白质变量理论被国际生物化学界广泛接受。可以导致蛋白质变形的有许多因素，主要分为两类：一是化学因素的变化，包括酸、碱、有机溶剂、硫酸钠、盐酸和表面活性剂；另一种是由热、射线、x射线和超声等物理因素引起的。在上述条件下，通过不同的物理和化学方法，可以确定不同的蛋白质结构在变形过程中的革质化特征。在实验的基础上，随着退化因素的逐渐增强，不同的物理和化学方法无法测量蛋白质的扩展。实验数据在同一s的变形曲线上相同。由于不同的物理和化学方法反映了不同的蛋白质结构的变化，因此在水质变化过程中，物质分子的状态是自然的，没有变化。从二氧化学和化学动力学的假设出发，在平衡条件下，不同的物理和化学变量模型可以用于测量。在这项研究中，由于不同的物理和化学变量模型，可以说是一个基本的研究方法。对于一般的行为，由于不同的物理和化学变量模型，可以证明在物质和物质作用的变化过程中，物质和功能的核心单元在物质和物质作用方面的变化是不同的。因此，在一般评价的条件下，采用化学法和化学-动力学作为基本的研究方法，以及不同的物理和化学变量模型。对于不同的武状化分析，虽然不同的半体验公式中测量的实验数据是相同的，但从二氧化学和化学变量模型可以看出是不同的。从二氧化学和化学力学作为基本的研究方法，可以看出。1fapp与变性因素间的物理转换对蛋白质变性过程的研究得出其遵循二态模型假说的结论,其出发点是考虑到变性曲线呈现为典型S型曲线,认为变性过程无明显稳定的中间态,而所有各步均为瞬态,这一结论的导出是从分析实验曲线得到的间接结果.能够直接检验二态模型假说正确与否的关键是寻找二态之间存在稳定中间态的证据,中间态存在的证据对于理解蛋白质分子解折叠的机理具有重要意义.在理论上主要是从平衡的观点出发,采用化学反应平衡方法对上述转换过程进行讨论.一般假定总的反应可表示为:N⇌X1⇌X2⋯⇌D(1)Ν⇌X1⇌X2⋯⇌D(1)式(1)中每一Xi均为稳定的中间态.若用某一物理量y来跟踪构象变化过程,当构象变化时y将随变性剂或温度变化而发生改变.在一定变性剂浓度或温度条件下,各种成份处于平衡态,观测的物理量y由下式给出:y=fNyN+fDyD+∑ifiyi(2)y=fΝyΝ+fDyD+∑ifiyi(2)上式中fN和fD分别为天然蛋白质和完全变性蛋白质所占的组份,fi为第i个中间态所占的组份,yN,yD,yi分别表示蛋白质处在天然态、完全变性态和第i个中间态时,物理参量y所取的值.由归一化条件可得到:fN=1−fD−∑fi(3)fΝ=1-fD-∑fi(3)并将其代入(2)式中,经整理后可以得到表观变性组份fapp的表示式:fapp=y−yNyD−yN=fD+∑ifidi(4)fapp=y-yΝyD-yΝ=fD+∑ifidi(4)式(4)中di=yi−yNyD−yN(0≤di≤1)(5)di=yi-yΝyD-yΝ(0≤di≤1)(5)一般情况下参数di在0和1之间取值,即表示第i个中间体的物理特征值是在天然态和完全变性态的值之间变化.从式(4)及(5)可知fapp的数值一般是与物理性质参数(di)有关.当无中间体时fi=0,则有fapp=fD,y=fNyN+fDyD,这表明转换过程为二态过程,此时fapp与di无关,fapp与用于实际测量的物理参数di无关,即对于不同的物理参量,fapp与变性因素(变性剂、温度等)之间满足相同的函数关系.在这一结论基础上通常设计实验去检验有无中间态存在.若有中间态存在时,得到的fapp值一定随选取不同物理参数而发生变化,因为任一di值不可能对于所有测量的不同的物理性质是一样的.实际上除了二态过程外,当式(2)中fN=0,fD=0,fi=1时,y=yi,对选取的不同物理参量,fapp与变性因素之间也可满足同样的函数关系.这表示在转换过程中所有蛋白质分子均处于某一中间态,在此中间态测量到的物理参数值为y.对应于这种情况的变性过程可表示为:N⇒X1⇒X2⇒⋯⇒D(6)Ν⇒X1⇒X2⇒⋯⇒D(6)上式表明在一定变性因素条件下,不是各种组份同时存在并处于平衡态,而是仅出现某一确定的中间态.所以通常在用不同物理参数测定某些蛋白质的转换过程时,若得到fapp与变性因素之间满足同样的函数关系时,这并不能说明蛋白质的转换过程就一定是二态过程.实验上对尿素诱导的蛋白质变性过程的分析表明,蛋白质变性是一个构象渐变的过程.这一实验结果也进一步证实了表示式(5)的正确性.2盐酸醚诱导的蛋白质变性蛋白质变性实验表明,蛋白质分子在高浓度(6M)的盐酸胍溶液中将处于完全伸展的构象态.盐酸胍分子的结构反映出,当它和其它分子以氢键形式结合时,可以作为质子供体,具体分析可知有四个基团可作为质子供体.实验结果表明蛋白质分子与盐酸胍分子之间以形成氢键方式相结合,并且是多氢键形式结合.模型化合物实验表明,盐酸胍分子与肽链上的两个相邻肽段间可形成一个环状结构,这种双氢键结合形式较单氢键结合在水中更稳定.Privalov等人对结合位点与蛋白质结构参数之间的关联进行分析,发现可以认为一个盐酸胍分子与蛋白质分子主链上的两个相邻肽段的羰基氧原子形成双氢键.以下我们将从这一实验结果出发,讨论盐酸胍分子与蛋白质分子之间的相互作用机理.为了便于分析,讨论将仅限于单结构域蛋白质分子的变性,绝大多数单结构域蛋白质变性时,变性过程呈现为典型的S型变性曲线,这表明蛋白质变性为一个协同过程.为了描述这种协同作用过程,假设盐酸胍诱导的蛋白质分子的解折叠过程可表示为P+nG⇌kdkaPGn(7)Ρ+nG⇌kdkaΡGn(7)(7)式中P表示蛋白质分子,G表示盐酸胍分子,参数n为Hill协同系数.ka为盐酸胍分子吸附到蛋白质分子上结合位点的吸附速率,kd为盐酸胍分子脱离蛋白质分子上结合位点的脱附速率.对应的稳态速率方程可表示为knaLnfa(θ)=kndfd(θ)(8)kanLnfa(θ)=kdnfd(θ)(8)(9)式中表示盐酸胍溶液的浓度,fa(θ)是肽链上两个相邻的结合位点未被占据的几率,fd(θ)是肽链上两个相邻的结合位点被占据的几率.θ为肽链上结合位点被占据的分数,也被称为肽链上结合位点的复盖度.fa(θ)和fd(θ)的表达式可表示为:fa(θ)=(1−θ)Z(1−θ)Z−θ(9)fd(θ)=(Z−1)2Z(Z−θ)θ2(10)fa(θ)=(1-θ)Ζ(1-θ)Ζ-θ(9)fd(θ)=(Ζ-1)2Ζ(Ζ-θ)θ2(10)参数Z是配位数,表示一个结合位点附近的最邻近的结合位点数.对于蛋白质多肽链而言,配位数Z=2.记K=kakd,KΚ=kakd,Κ表示表观吸附常数,关系式(9)又可表示为KnLnfa(θ)=fd(θ)(11)ΚnLnfa(θ)=fd(θ)(11)引入θ的定义θ=y−yNyD−yN(12)θ=y-yΝyD-yΝ(12)将式(9)-(11)代入(12)式可得θ=(ZZ−1)Kn/2Ln/21+(ZZ−1)Kn/2Ln/2(13)θ=(ΖΖ-1)Κn/2Ln/21+(ΖΖ-1)Κn/2Ln/2(13)由式(13)和(14)可得y=yN+(yD−yN)(ZZ−1)Kn/2Ln/21+(ZZ−1)Kn/2Ln/2(14)y=yΝ+(yD-yΝ)(ΖΖ-1)Κn/2Ln/21+(ΖΖ-1)Κn/2Ln/2(14)(13)和(14)式给出了参量θ与盐酸胍浓度L之间的对应关系.当(14)式中n=1时,(14)式将化为文献中的(24.25a)式.从构象渐变的观点看,参量θ表示在变性过程中蛋白质分子构象变化的程度,而不是二态模型假说所描述的处于完全变性态的蛋白质分子所占的分数.另外,物理参量y的不同值对应不同的中间态,这表明测量参量y的变化情况可以跟踪蛋白质变性过程,所以从构象渐变观点所得结果与二态模型所描述的过程是有着本质区别的.有关盐酸胍诱导的蛋白质变性的实验资料已积累很多,实验上观察到单结构域蛋白质的变性曲线呈现为典型的S型曲线.从上述分析可知盐酸胍诱导的真实蛋白质的变性为一个构象渐变过程,导出了描述这一过程的关系式(13)和(14).下面将利用(13)式和(14)式对盐酸胍诱导的几种蛋白质变性过程进行理论分析,并将所得理论结果与实验数据相比较.蛋白质变性时,表征蛋白质分子结构的物理参数将随之发生改变,跟踪这些参量的变化可以掌握蛋白质变性过程的变化规律.监测圆二色性(CD)和荧光光谱值的变化可用来跟踪蛋白质变性过程,蛋白质变性时构象发生变化,必然导致跟踪物理参数的值发生变化,若找到物理参数y与盐酸胍浓度L的关系,就可以定量研究在盐酸胍作用下蛋白质分子的构象变化规律.下面首先对盐酸胍诱导的溶菌酶(T4lysozyme)的变性过程进行讨论.图1反映了溶菌酶变性时,圆二色性的摩尔椭圆度值随盐酸胍溶液浓度的变化关系.这种变化呈现出典型的S型变化趋势,反映了溶菌酶在变性过程中其空间结构中的二级结构含量的变化,即溶菌酶处在完全变性态时分子的空间结构中α-螺旋结构和β-折叠结构将消失,当式(14)中选取参量值为K=0.38,n=36时,(14)式对应的理论曲线与实验测量值符合较好.图2为糜蛋白酶抑制剂因子2(ChymotrypsinInhibitor2)的变性过程,随着盐酸胍浓度的增加,糜蛋白酶抑制剂因子2的荧光光谱值将发生改变.它反映出糜蛋白酶抑制剂因子2变性时所经历的构象变化过程,当(14)式中参数值取K=0.24,n=22时理论曲线与实验值相符合.3盐酸醚诱导的蛋白质变性本文在分析以往实验事实的基础上,提出了蛋白质分子与一个盐酸胍分子之间形成双氢键的相互作用假设.从这一假设出发导出了跟踪变性过程的可观测物理参量y与盐酸胍浓度L之间的关系式,下面我们将对以上所得结果做较深入的讨论并从理论上给出某些新的预测结果.3.1在以往的蛋白质变性研究中,研究者通常认为无论是变性剂诱导的或温度诱导的蛋白质变性,变性后的蛋白质分子的构象均是无规卷曲线团.但从本文所提出的蛋白质分子与盐酸胍分子相互作用机理可知,盐酸胍分子被吸附到蛋白质分子上将导致蛋白质多肽链具有一定的刚性,而热变性时处于完全变性态的蛋白质分子则由于所有弱键被破坏而其构象为无规卷曲线团,这种效应必将反映为同一种蛋白质在热变性和在盐酸胍变性情况下,所得到的本征粘度值不同,其中由于盐酸胍诱导的蛋白质变性时,已完全变性的蛋白质分子具有一定的刚性因而具有较大的本征粘度值,这一预测结果与已知的实验测量结果是一致的.3.2图1表明圆二色性(CD)可用来跟踪蛋白质变性过程,CD值的变化反映蛋白质分子内二级结构含量的变化.从图1可知只有达到一定的盐酸胍浓度值时,某种蛋白质分子内二级结构的含量才会产生显著的变化.当盐酸胍浓度逐渐增加时,蛋白质分子二级结构的含量将逐步减少直至消失.从序变观点对盐酸胍诱导的蛋白质变性可解释为,在不同浓度的盐酸胍溶液中蛋白质分子处于不同的稳定中间态,这些中间态对盐酸胍浓度敏感依赖.蛋白质变性时由于分子内的二级结构含量发生显著变化,必然导致蛋白质分子的体积发生改变,这表明处在不同的中间态时,蛋白质分子对应不同的分子体积,实验上本征粘度值[η]可以从表观上反映蛋白质分子的构象变化,通过测定蛋白质变性过程中本征粘度[η]的变化,可确定本征粘度值与盐酸胍浓度之间的关系.当单结构域蛋白质分子变性时,用不同的物理化学方法测定蛋白质的伸展程度,所得到的实验数据都落到同一条S型变性曲线上.这说明若跟踪变性过程的物理参量y取为本征粘度值,则式(13)和(14)可表示本征粘度[η]随盐酸胍浓度L变化的关系.由于本征粘度[η]与分子体积之间的关系,我们认为式(13)和(14)也可以描述蛋白质分子体积随盐酸胍浓度变化的关系.3.3图2表明通过测定荧光光谱值的变化也同样可以跟踪蛋白质变性过程.在蛋白质分子中,能发射荧光的氨基酸残基,只有Trp、Tyr以及Phe.当蛋白质变性时,蛋白质分子的空间结构发生改变,导致上述残基所处的微环境发生变化,从而使测得的荧光光谱值将随盐酸胍浓度的改变而发生变化.由糜蛋白酶抑制剂因子2(CI2)的天然结构可知,它仅含有一个埋入其疏水核内的Trp残基.按照构象渐变的观点解释图2所显示的变性过程为:色氨酸残基的微观环境随盐酸胍浓度的增加而以渐变形式发生变化,反映了变性时芳香族基团由分子内部非极性环境逐步暴露于溶剂中.这一过程也必然伴随着蛋白质分子内二级结构含量和分子体积的同步变化,用不同物理参量监测同一单结构域蛋白质的变性过程,所得实验