普通丝瓜杂交种纯度鉴定SSR法技术规程

普通丝瓜杂交种纯度鉴定SSR法技术规程1范围本文件从丝瓜种子发芽、DNA提取、PCR反应、电泳检测、结果统计与计算等流程上规范了普通丝瓜杂交种纯度鉴定SSR法技术规程。本文件适用于普通丝瓜杂交种纯度鉴定，文件中简称丝瓜。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本规程必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T3543.1农作物种子检验规程GB16715.1瓜菜作物种子，瓜类3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1杂交种纯度HybridSeedPurity杂交种纯度是杂交种在特征特性方面典型一致的程度，本标准中指杂交种在SSR带型上典型一致的程度。用具有本杂交种特异带型的种子数占供检样本种子总粒数的百分率表示。3.2分子标记MolecularMarker以核酸或蛋白质的多态性为基础，能显示生物遗传差异的标记。3.3简单重复序列SimpleSequenceRepeat也称为微卫星DNA，是一类由几个核苷酸（一般1-6个）为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列，广泛存在于真核生物基因组中。基于个体基因组中微卫星DNA重复单元在数量上存在多态性，可鉴别不同个体。3.4SSR分子标记SSRMolecularMarker近年来发展起来的一种以特异引物PCR为基础的分子标记技术。由于每个SSR两侧的序列一般是相对保守的单拷贝序列，可根据保守的碱基序列设计特异引物，将简单重复序列扩增出来。不同个体的扩增产物在条带上的变化产生多态性，即成为SSR分子标记。4原理SSR标记技术是一种以特异引物PCR扩增为基础的分子标记技术。由于SSR标记广泛存在于植物基因组上，不同材料每个位点重复单位的数量及序列可能不同，故而形成扩增片段的长度多态性。根据扩增片段电泳谱带的差异，可鉴定杂交种纯度。5主要仪器设备、试剂耗材5.1主要仪器设备研钵、镊子、电子天平、高速台式离心机、恒温水浴锅、紫外分光光度计、PCR扩增仪、电泳仪、垂直电泳槽、凝胶成像系统、酸度计、微量移液器、摇床、高压灭菌锅、通风柜、胶片观察灯、数码相机、冰箱（4℃冰箱和-20℃冰箱各一台）。5.2主要试剂乙二胺四乙酸二钠（Ethylenediaminetetraaceticaciddisodiumsalt，EDTANa2）、盐酸（HCl）、氢氧化钠（NaOH）、三羟甲基氨基甲烷【Tris（hydroxymethyl）methylaminomethane，Tris）】、三氯甲烷（Chloroform）、十二烷基磺酸钠（Sodiumdodecylsulfonate，SDS）、乙醇（Ethanol）、异丙醇（Isopropanol）、异戊醇（Isoamylalcohol）、TaqDNA聚合酶、dNTP（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）、引物、丙烯酰胺（Acrylamide）、甲叉双丙烯酰胺（N，N，-methylemebisacrylamide）、四甲基乙二胺（TEMED）、硼酸（Boricacid）、过硫酸铵（Ammoniumpersulfate）、硝酸银（Silvernitrate）、冰醋酸（Glacialaceticacid）、醋酸钠（Sodiumacetate）、甲醛（Formaldehyde）。5.3主要耗材离心管（0.6ml、1.5ml、2.0ml）、枪头（白枪头、黄枪头、蓝枪头）、枪头盒、48孔板、96孔PCR扩增板、96孔PCR扩增板管盖、量筒、发芽盒、玻璃板、玻璃棒、一次性手套、一次性口罩。6试剂配制相关试剂配制方法见附录A7引物以送检丝瓜杂交种及其双亲DNA为模板，用SSR引物进行PCR扩增，筛选带型清晰、差异明显、互补性好的引物作为纯度鉴定的SSR分子标记。部分SSR引物信息见附录B8鉴定流程8.1种子催芽与取样供试丝瓜杂交种约250粒，父母本各10粒（对存在休眠的白丝瓜种子，可通过机械破壁的方法在种皮边缘剪一小口）浸入温水中，浸种5-6h后置于垫有2-3层无菌滤纸的发芽盒，37℃恒温，并注意保湿。期间带菌种子易发霉，可每日用流水冲洗，揉搓至种子表面无菌斑后，重新放发芽盒催芽。2-4天后，种子露出子叶。用镊子夹取发芽种子胚轴约0.5至1cm，置于2ml离心管或者96孔PCR板，用于DNA提取。8.2DNA提取可采用CTAB小样法或者快速碱煮法提取。CTAB小样法（1）将丝瓜样品放于研钵中，加入0.8mlDNA缓冲液，研磨均匀，将磨好的样品倒回至2ml离心管，冰上放置或者放冰箱冷冻。（2）将研磨好的样品放置于48孔板架上，60℃水浴30min，中间每隔5min摇一次，使样品受热均匀。（3）取出管架，打开2ml离心管管盖，然后加入0.8ml氯仿:异戊醇（24:1）溶液，颠倒混匀（需带手套，防止损伤皮肤）。（4）室温下静置5-10min后10，000rpm离心5min；将上清仔细移至另一2ml离心管，加入1倍体积异丙醇，混匀，室温静置3min，5，000rpm离心5min，去除上清。（5）用70%的乙醇洗涤沉淀2次，待乙醇全部风干后，加入500µl60℃预热的ddH2O，再加入5µlRNaseA（10μg/µl），37℃温浴10min，最后加入1/10体积的3mol/LNaAc及2×体积的冰乙醇，混匀，-20℃放置20min。（6）5，000rpm离心5min，去上清，用70%的乙醇洗涤沉淀2次，风干乙醇后加入200µlddH2O。（7）用紫外分光光度计检测DNA浓度并将DNA溶液用ddH2O稀释到20ng/µl，-20℃冰箱中保存备用。快速碱煮法用镊子将丝瓜胚轴放入96孔PCR板管底底部，并加入0.25mol/L的NaOH溶液50µl，用96孔板盖盖好PCR板。将带有样品的96孔PCR板置于沸水中煮3min，用镊子戴手套取出PCR板置于桌面，最后加入0.1mol/L的Tris﹒HCl（pH=8.0）150µl中和反应。本方法提取的DNA容易降解，在4℃冰箱最长可保存3-4天。8.3PCR扩增PCR扩增体系PCR扩增采用为10µl体系，10ng/µlDNA模板约0.5µl，10×Buffer1µl，10mmol/ldNTP0.1µl，10pmol/lSSR引物0.2µl，2.5U/µlrTaq0.1µl，加灭菌ddH2O至总体积10µl。PCR反应程序PCR反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，最后72℃延伸5min。加入上样缓冲液PCR结束后，在每孔中加入2µl6×加样缓冲液，混匀，置于4℃冰箱待检测。8.4电泳检测对于扩增条带大小差别不大的扩增产物采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，扩增条带大小差别较大的扩增产物建议采用普通X脂糖凝胶电泳。8.4.1变性聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳装置准备用自来水加少许清洗液将玻璃板清洗干净，再用ddH2O冲洗2-3遍，透光条件下玻璃板上无细小杂质时将玻璃板垂直放置，自然条件下晾干。晾干后，盖上凹槽玻璃板，将玻璃板放在塑料隔条中，仔细对齐玻璃板，使玻璃板与塑料隔条紧密吻合。利用X脂糖凝胶封好玻璃板，防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出。封胶时称0.3gX脂粉，加30ml1×TBE缓冲液，微波炉上加热完全溶解后，用5ml移液器取适量加到玻璃板下面的空隙里，X胶液以渗入玻璃板凹槽中3mm左右，室温放置30min使其充分冷却。将封胶好的玻璃板放在电泳槽中，使玻璃板周边的塑料条与电泳槽的卡位紧密吻合，将螺丝拧紧，将电泳槽的正极和负极分别与电泳仪连接。灌胶将现配的8%PAGE（丙烯酰胺）凝胶，轻轻摇匀，缓缓灌入玻璃胶室，胶灌满整个胶室后，插入样品梳，室温下聚合90min。胶完全聚合后，加入0.5×TBE电泳缓冲液，拔出样品梳。点样与电泳检测每个PCR扩增产物中加2µl6×加样缓冲液，充分混匀后，每个加样孔加入3µl样品，并设置标准分子量DNA作片段大小标准。180V恒温电泳90min左右，待指示剂（6×加样缓冲液中的二甲苯青）接近胶板底部时，停止电泳。染色、显色和拍照电泳结束后，轻轻分开两块玻璃板，将凝胶放在专用盆中，加入500ml蒸馏水清洗2-3遍后，放入染色液中，染色3-5min，取出胶板，用蒸馏水漂洗2-3次。将胶板放入盛有400ml显影液的托盘中，托盘制摇床上，轻轻摇动至条带清晰后，迅速用蒸馏水漂洗3-5遍，将胶用保鲜膜包好，置于胶片观察灯上，观察带型并拍照记录。普通X脂糖凝胶电泳将PCR产物与2µl6×加样缓冲液混合，点样至1.0-3.0%的X脂糖凝胶点样孔内（含有0.5µg/ml的溴化乙锭或者其它指示剂，制胶浓度根据扩增片段差异大小定），同时设置标准分子量DNA作片段大小标准，在1×TAE缓冲液中进行凝胶电泳，电泳电压120V，电泳时间约30min，具体根据扩增片段大小确定，并在凝胶成像系统控制软件上观察记录PCR扩增条带。9纯度计算如果SSR扩增条带表现双亲带型，说明是杂交种；如果表现任一亲本带型或者其它带型，则认为该种子为假杂种。分别统计杂交种和假杂种的样品数量，根据公式：SSR纯度=（检测总数-非杂交种谱带类型的个体数量）/检测总数×100%，计算杂交种纯度。附件A常用试剂配方1DNA提取试剂1.10.5mol/LEDTA（乙二胺四乙酸二钠盐）（pH8.0）溶液称EDTA186.1g，加入已有800ml双蒸水的烧杯中，用氢氧化钠调节pH值至8.0，补双蒸水至1000ml，用玻璃棒搅拌、摇匀，分装至100ml的玻璃瓶中，高压蒸汽灭菌（121℃，20min）后，置于4℃冰箱中保存备用。1.21mol/LTris-HCl（三羟基氨基甲烷盐酸，pH8.0）溶液称121.1gTris加入含有800ml双蒸水的烧杯中，用盐酸调节pH值至8.0，补双蒸水定容至1L，摇匀，4℃冰箱中保存备用。1.3DNA提取液取1mol/LTris-HCl溶液50ml、0.5mol/LEDTA溶液20ml，称SDS7.5g和氯化钠14.6g加入到500ml烧杯中，用双蒸水定容至500ml，充分混匀，使得溶液中的最终浓度为Tris•HCl100mmol/L，EDTA20mMol/L，NaCl500mmol/L，SDS1.5%（v/v）。1.4氯仿:异戊醇:乙醇（80:4:16）取160ml三氯甲烷，8ml异戊醇和32ml乙醇加在一起混匀，4℃冰箱保存备用。1.50.25mol/L的NaOH称取NaOH1g，加入双蒸水定容至100ml。1.60.1mol/L的Tris﹒HCl取1mol/LTris-HCl（pH8.0）10ml，加双蒸水定容至100ml。2PCR扩增试剂PCR扩增所用的dNTP，TaqDNA聚合酶均从试剂公司（XX全式金生物技术有限公司）购买，-20℃保存备用。引物委托XX生工生物工程公司合成，并将合成后的正向和反向引物用灭菌的双蒸水配置成100µM的储存液，从中取10µl加90µl双蒸水配置成10µM的工作液，-20℃保存备用。3变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂3.110×TBE缓冲液称取108gTris，55g硼酸，40ml0.5MEDTA（pH8.0），加入烧杯中，用双蒸水定容到1L，摇匀。3.210%（W/V）过硫酸铵溶液（APS）称0.1g过硫酸铵，加入1ml双蒸水，混匀，现配现用（保质期48h）。3.31×TBE缓冲液取10×TBE缓冲液200ml，加双蒸水1800ml，摇匀。3.41×TAE缓冲液取10×TAE缓冲液200ml，加双蒸水1800ml，摇匀。3.56×加样缓冲液称取溴酚蓝0.25g，二甲苯青0.25g，加98ml甲酰胺溶液和2mlEDTA（pH8.0）溶液溶解，混匀，-20℃保存备用。3.68%PAGE（丙烯酰胺）凝胶40%PAGE8ml、10×TBE4ml、ddH2028ml、10%AP400µl、TEMED20µl，总体积40ml，实践中可根据垂直板的大小按比例配置凝胶。4银染、显影试剂4.1染色液称1.5g硝酸银，加双蒸水1000ml溶解，再加1.5ml甲醛混匀。4.2显影液称15g氢氧化钠，加入1000ml双蒸水溶解，再加7.5ml甲醛，混匀。附件B引物信息本规程对“兴蔬早佳”丝瓜采用引物S32进行了纯度鉴定，鉴XX果与田间鉴XX果无显著差异。对于其它丝瓜杂交种，需要进行引物筛选，附录中提供了部分SSR引物信息，更多引物设计请参考国际葫芦科基因组网站（://）公布的信息。部分SSR引物信息引物编号5'-3'正向引物序列3'-5'正向引物序列S01CTCCCTCTTTCCCTCACTCCGACAGGACCGTTAACCCAAAS02TAAATACCCGCCTCGAACACTCCATCCCAGATTTTGCTTCS03GGGAGAACAAGATAGCCCAATGCAAACTTCGATTTGCTCAS04CAGCTCTACAACAACATCTCATCATTGGATGTGGGATTCTCS05AAGATTGAAGTGGGAAAATGCGGCAATCATCTTATCTTTCS06TGGAGTGTTGACATTGTTTTCAGGTTGGAGTAAGCCAAATTACAS07TTGAAGATGAAGCCGGAGTTCTAGAGTCAGATGCCTCGCCS08AGAATAAGGTCCACATAAGGGTTAAAGGCTATGGTATAGAACS09CAGCTCTACAACAACATCTCATCCAACTCGACCAAGAAACS10ACTCAATCCAACCCACGAATAGTGGCATTTGAACGCTAAGTTGS11TTCGCCTCAGTCCATCTAGTTTATGTCGTACCTTTTCCCCTTTTS12TTTGAATCTCGCCATGAAGCTACCCTGTTTTGCAGCTACGS13CTCCTCAAGAAAATCCACTTCCCCAGGTAATTCTCCTCCATGTCS14TATTGCCCCAAACTCTTCTCTCATGGACAAAACTTCATAACGCCS15GAAGTTTGAGAAGGGGTTTCAGTTCTTCCCTATCCATCATCACCS16TTCCCCATCCATACATTTCTTCCCCTCTCTTCTCCATTTTCTCAS17GGCGGAATACAAGAAAGATACCCATGTGAAAAGGGAACAGAGAAS18CCAACTATCACCCCTACAATCAGGACAGAACCTAAAAGAAAGAAGAGS19GTCTTCCTGAGAGCTTTTGCATCCCTCTTCTCCTTCGATCTTCTS20AACCTCTCGTCATTACTACCGCGTGACTAAAAGCGTGTGAGTGGS21CGTTTGAGATGTGTGCATGTAGTTAAGAGACTGGTTGGAGTTGAGAS22TACCTTCACCCAACTCGCTATTGTGTGTGTTTGATCGGCTGTTS23TTTGTTCTATTCCCCTCTTCCATCGATTACGACGACTTTCTTGAS24TCAGGAAGTGGAGACAACACCGGGAAAAGACTGCACCATCAS25GCTCTCGATTCTAACCAAAACCTCATTCTACCTCTCCAATTCCAS26ACATTTTCACTAGCAGAAGGGGGTGCCCATGTATAGGAAGCAAS27GAAAGAAGGCGAGGAGTGTAGAGAAAAGGAAAGTTGGGGTGTTTS28TTTGGGCTCTGACATTAGATGAACACCTTTGGGAGATAACAAGCS29CTCCAAGGAAGAAGAAGAAACCAATACTGCCACATCATCAGCTCS30GGAGGAGGGAAGAGGAGATGAGGTAAAGCAACAACCCCATAAS31GTCGCCACCGTTGAGTTTAACCTTAATCCGGCTAGGAAAGS32CATCACCACCACCACAACCGCCACCAAAATCAGCTCTATGS33AGAAGTGGGAGATTGAACATGCGTTGGTATGTGAACCTTGAGGCS34TCCACCAACTC