人血清胎盘泌乳素的化学发光免疫分析方法的建立

人血清胎盘泌乳素的化学发光免疫分析方法的建立

胎盘分泌激素（hpl）是胎盘毛囊膜合体产生并分泌的激素。它的主要生理功能是刺激乳房生长，调节祖母代谢，促进胎儿生长发育。测定母血中HPL含量,有助于了解胎盘机能及胎儿发育状况,对高危妊娠诊断有临床意义。本文根据化学发光免疫分析法的原理建立了血清HPL的定量检测方法。1材料和方法1.1聚合物pa①HPL单克隆抗体为美国scripps公司产品。②HPL多克隆抗体为DAKO公司产品。③HPL校准品为本实验室自制。④辣根过氧化物酶(HRP)为bioenzyme公司产品。⑤鲁米诺为sigma公司产品。⑥对碘苯酚为FLUKA公司产品。⑦过氧化脲为sigma公司产品。1.2方法1.2.1标准物质的制备将校准品用中国药品生物制品检定所国家标准品标定效价后,用FCS稀释成0、0.4、1、5、10和20mg/L6个浓度值。1.2.2诺、对碘苯酚和edta的终浓度A液:0.05mol/LpH9.0的Tris-Hcl中加入鲁米诺、对碘苯酚和EDTA,终浓度相应为1.25mmol/L、1.25mmol/L和1mmol/L。B液:0.1mol/LpH7.0的柠檬酸-醋酸钠缓冲液中加入过氧化脲至终浓度为0.03%。1.2.3包被板和包被板的制备HPL单抗用0.05mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液配制成5μg/ml的浓度,然后按100μl/孔加入包被板中,37℃包被2h,再用含1%BSA的0.01mol/LpH7.4PBS37℃封闭2h后备用。1.2.4-hp-igg的合成①4mg的HRP溶于1ml的去离子水中,加入0.1mol/L的NaIO40.2ml,4℃反应1h。②加入乙二醇104μl,4℃反应0.5h。③对1mmol/LpH4.4的醋酸缓冲液透析。④加入含8mg抗HPLIgG的0.05mol/LpH9.5碳酸盐缓冲液1ml,25℃反应2.5h。⑤加入4mg/ml的NaBH40.1ml,4℃反应2h。⑥对0.01mol/LpH7.4的PBS透析。⑦纯化IgG-HRP,用10%FCS的0.01mol/LpH7.4PBS1∶1000稀释成工作液。1.2.5hpl浓度对rlu的影响样本按50μl/孔加样,反应60min后用洗液洗掉未结合的成分,然后加酶标抗体,100μl/孔,反应60min,用洗液洗掉未结合成分,加入发光底物工作液(A、B底物工作液各50μl/孔),于发光反应进行约2min时测定各样本孔的发光值RLU。样本的RLU与其中的HPL浓度呈正相相关。样本中的HPL浓度依据由校准品HPL浓度和对应的RLU建立的数学模型进行定量。2结果2.1开口灵活平行测定20孔零值校准品,以0+2SD作为最低检测限,得出灵敏度为0.1mg/L。2.2批内变异系数和批间变异系数分别用HPL含量为高、中、低的质控血清进行精密性测定,结果批内变异系数分别为3.88%、3.37%和4.21%(n=20),批间变异系数分别为8.33%、7.06%和6.91%(n=20)。2.3准确性测试样品的加入回收率和稀释回收率。结果加入回收率在89.8%~108.3%之间。样品稀释回收率在86.4%~112.1%之间。2.4hdge、肢体泌乳素和hcg交叉反应率分别用HPL含量为高中低的血清将HGH、垂体泌乳素和HCG纯品配制成100μg/L、200μg/L、2000IU/L的浓度,共9份样品。用本法测定与HGH、垂体泌乳素和HCG交叉反应率。结果,交叉反应率分别为0.045%、0.076%、0.0032%。2.5血清hpl现有值的确定测定212例正常妊娠并处于不同孕周的孕妇血清中的HPL含量,以HPL含量平均值加减两个标准差(SD)作为血清HPL正常值的上下限,确定正常值范围为0.5~12.5mg/L。2.6临床标本检测与临床标本检测的相关性分析本法与美国DPC公司的HPL放免检测试剂盒共同对116份临床标本进行检测,通过数据分析,得出两个检测系统所得数值具有显著相关性。相关方程为CLIA=1.0285×DPC+0.42(n=116),r=0.983,P<0.001。3hpl的量化检测分析方法的提出目前国内外用于HPL定量检测的方法很多,其中放射免疫法和酶联免疫法是HPL临床测定的最常用方法,放射免疫法具有敏感性高,特异性好的优点,但却存在放射性污染的问题;酶联免疫法不存在放射性污染的问题,但却具有敏感度相对较低,定量测定范围窄的缺点;化学发光免疫分析法是20世纪80年代兴起的一种微量物质的分析方法,它不仅具备了检测的高敏感性、高特异性、定量测定范围宽、代检样本无需稀释等诸多优点,而且不存在环境的放射性污染问题,因此已被用于许多物质的定量测定,本研究旨在利用本实验室所具备的化学发光免疫分析平台来建立HPL的化学发光免疫分析法。从降低应用成本出发,本工作选用鲁米诺作为发光底物,并通过加入增强剂对碘苯酚来增强发光,发光底物的合理配方使得底物的发光强度和发光时间都达到了要求。考虑到HPL和HGH在结构上有很大的相似性,选用一株对HPL保守位点特异的单克隆抗体作为包被抗体来提高分析方法的特异性,结果显示该方法与HGH、垂体泌乳素和HCG都具有很小的交叉反应率。本工作建立的HPL的化学发光免疫分析方法,通过方法学鉴定表明其灵敏度、特异性,精密度等技术指标均达到了临床诊断的要求,与进口HPL放射免疫检测试剂盒相比也具有很好的临床相关性;同时本工作建立的分析方法由于所用的大部分原料试剂均为自行制备,应用成本低,从而也为HPL定量检测试剂盒的研制打下了基础;另外该分