第五次课程凝集试验沉淀反应

实验五、凝集试验和沉淀反应目的要求熟悉玻板凝集试验和试管凝集试验的操作技术。掌握凝集反应中阴阳性结果的判定。掌握炭疽杆菌环状沉淀试验的操作技术和结果观察。实验材料

布氏杆菌试管凝集抗原、布氏杆菌虎红平板凝集抗原、布氏杆菌标准阳性血清、布氏杆菌标准阴性血清、待检血清、生理盐水、玻板（1cm×8cm）、试管、微量加样器。炭疽沉淀抗原、炭疽沉淀血清、口径0.4cm的小试管、毛细滴管实验内容及操作程序

1、布氏杆菌虎红平板凝集试验：取洁净玻板一块，用蜡笔划成方格，并注明待检血清号码。加被检血清和布氏杆菌虎红平板凝集抗原各0.03ml于方格内，每份血清各用一根火柴棒或牙签混合均匀。同时设阴、阳性血清对照。混匀完毕后，将玻板置室温（20℃）4～10min内记录反应结果。结果判定在阳性血清和阴性血清试验结果正确的对照下，被检血清出现任何程度的凝集现象均判为阳性，完全不凝集的判为阴性，无可疑反应。2、布氏杆菌试管凝集试验加样：每份血清用试管4支，另取对照试管3支，置试管架上。如待检血清有多份，对照只需1份。按表9—2先加0．5％石炭酸生理盐水，然后以1mL加样器吸取待检血清0.2mL，加入第1管中，充分混匀，吸出1.5mL弃之，再吸出0.5mL加入第2管，混匀后加入第3管，依此类推至第4管，混匀后弃去0.5mL。第5管中不加待检血清，第6管中加1：25稀释的布氏杆菌阳性血清0.5mL，第7管中加入1：25稀释的布氏杆菌阴性血清0．5mL。加抗原各加入以0．5％石炭酸生理盐水稀释20倍的布氏杆菌试管凝集抗原0．5mL。作用:

在各试管加完抗原后，将7支试管同时充分混匀，置37℃培养箱中4～10h，取出后置室温18～24h，然后观察并记录结果。待检血清稀释度：猪、羊、狗为1：25，1：50，1：100，1：200；牛、马和骆驼为1：50，l：100，1：200，1：400等四个稀释度，大规模检疫可只用两个稀释度，即猪、羊、狗为1：25和1：50；牛、马、骆驼为l：50和1：100。布氏杆菌试管凝集试验管号1234567最终血清稀释度1：251：501：1001：200对照抗原对照阳性血清1：25阴性血清1：250.5%石炭酸生理盐水（mL）

2.30.50.50.50.5__被检血清（mL）

0.2

弃去1.50.50.50.5

弃去0.5_0.50.51：20抗原(mL)

0.50.50.50.50.50.50.5结果判定

++++：液体完全透明，菌体完全被凝集呈伞状沉于管底，振荡时，沉淀物呈片状、块状或颗粒状（即100％的菌体被凝集）。+++：液体略呈混浊，菌体大部分被凝集沉于管底，振荡时情况如上（75％菌体被凝集）。++：液体不甚透明，管底有明显的凝集沉淀，振荡时有块状或小片絮状物（50％菌体被凝集）。+：液体透明度不明显或不透明，有不甚显著的沉淀或仅有沉淀的痕迹（25％菌体被凝集）。-：液体不透明，管底无凝集，有时管底可见有一部分沉淀，但振荡后立即散开呈均匀混匀。判定标准牛、马和骆驼凝集价1：100以上，猪、绵羊、山羊和狗1：50以上为阳性。牛、马和骆驼1：50，猪、羊等1：25为可疑。3、炭疽环状沉淀试验

抗原处理如待检样为皮张可用冷浸法：检样置37℃温箱烘干，高压灭菌后，剪成小块称重，然后加入5～10倍的石炭酸生理盐水，放室温浸泡10～24h，用滤纸过滤2～3次，使之呈清朗的液体，此即为待检抗原。如有疑似炭疽杆菌的肉汤培养物，可将其121℃高压灭菌30分钟，离心取上清作为待检抗原。加样取3支口径0.4cm的小试管，用1mL注射器沿着试管内壁向底部各加约0.1mL的炭疽沉淀血清，再用其它的1mL注射器分别将待检抗原、炭疽阳性抗原、生理盐水沿着管壁重叠在炭疽沉淀血清之上，上下两液体间即出现整齐、明显的液界面。结果判定

5～10min内判定结果，上下重叠两液界面上出现乳白色环者，为炭疽阳性。对照组中，加炭疽阳性抗原者应出现白环，而加生理盐水者应不出现白环。温馨提示用刻度吸管从试管吸、放液体时，应待吸管轻放到试管底部后才松手，以免戮破试管。做试管