普洱茶水提物的分离筛选及化学成分分析

普洱茶水提物的分离筛选及化学成分分析

20世纪80年代末的分离和评价联合技术为研究活动因素提供了有利的条件。高效液相色谱(HPLC)法在茶叶多酚测定中被广泛利用[1~3],尤其通过紫外光电二极管阵列检测器,能对各个分离峰的鉴定提供许多有用的信息。但对天然产物中活性成分的化学结构进行更准确的鉴定,还需借助更精密的仪器,如核磁共振仪(NMR)、近红外光谱(NIR)和液质联用(LC-MS)等。其中液质联用法以适当接口(例如电喷雾离子化(ESI)、大气压离子化(APCI)接口)传输至质谱仪,对粗提物成分提供分子质量和结构信息。后发酵茶属我国特有的茶类,由于其独特的风味和保健功能,热销于国内外市场。以普洱茶为代表的后发酵茶与红、绿茶的主要区别在于前者经过特殊的加工工艺,在渥堆即“后发酵”的过程中形成了一些特异的多酚类物质(可能是儿茶素寡聚体为主的多酚类非酶性氧化产物)。中国科学院昆明植物所的研究人员从普洱茶中分离出一种高氧化的黑茶素类化合物(puerins),为普洱茶中存在特异多酚类物质提供了有力证据。鉴于普洱茶的特殊保健功能可能与其含有的特异多酚类物质(如儿茶素的寡聚体等)密切相关,因此有必要从化学组成和结构等方面对其进行研究。本文对普洱茶以及各萃取组分进行了体外清除自由基的能力测定;采用LC-MS法鉴定萃取组分中的活性成分,旨在了解我国后发酵茶独特的保健作用机理。1材料和方法1.1加样、本样的制备普洱茶粉,自制。取普洱茶(由浙江省茶叶进口公司提供,产地云南)以1∶10、1∶5的茶水比例在沸蒸馏水中浸提2次(30min),合并浸提液,真空冷冻干燥,得普洱茶粉(PTW)。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG,纯度>98%)与茶多酚(TP,纯度TP>95%,EGCG>40%)由浙江大学茶叶科技开发有限公司提供;二苯基苦基偕腙肼(DPPH)、儿茶素标样与茶黄素标样均购自Sigma公司;甲醇、乙腈(色谱纯)购自天津四友有限公司;其余试剂均为国产A.R级。1.2高效液相色谱分析LCMS-2010高效液质联用色谱仪(日本Shimadzu公司)配有LC-10AD泵、SPD-M10A二极管阵列检测器、DGU-14AM脱气装置、SIL-HTA自动进样器、CTO-10AS柱温箱、LCMS-2010A质谱、干燥气体控制器、SLP-221CD压缩机(AnestIwataCorporation,日本)与LCMSsolutionversion2.04色谱分析软件。1.3萃取组分的提取取40g普洱茶粉,用蒸馏水(质量比1∶10)配成溶液,倒入分液漏斗中,分别用等体积的氯仿、乙酸乙酯,正丁醇各萃取3次,每次萃取2h。氯仿萃取后所得氯仿层为PCF,乙酸乙酯萃取后所得乙酸乙酯层为PEAF,正丁醇层为PBF。正丁醇萃取后所得水层加乙醇至最终体积分数为75%,得到沉淀物PD与剩余相PR。将各萃取层旋转蒸发去除有机溶剂后转溶于水中,冷冻干燥得各萃取组分。萃取流程见图1。1.4方法1.4.1火炬对加样样品od测定的不同方法将溶于甲醇的DPPH(浓度1mmol/L)0.8mL,与2.4mL不同浓度的普洱茶各萃取组分的甲醇溶液混合,充分混匀后于暗室(室温)中放置30min,在517nm下测定吸光值OD样品。以甲醇代替各样品溶液作为对照测得吸光值ODck,DPPH清除率计算公式为:DPPH清除率(%)=(ODck-OD样品)×100/ODck。1.4.2流动相a5eHPLC-MS仪器中HPLC部分:UG120C-18柱:2.0mm×150mm,5μm(日本Shiseido公司);检测器波长200~600nm,柱温35℃,流速0.2mL/min,进样量10μL;流动相A为乙酸、乙腈和重蒸水(体积比0.5∶3∶96.5);流动相B为乙酸、乙腈和重蒸水(体积比0.5∶30∶69.5);洗脱梯度:0~45minB流动相由0%~100%,45~60minB流动相为100%。HPLC-MS仪器中MS部分:离子源:ESI(电喷雾),含正、负离子,质量范围100~900m/z。干燥气体流速1.5L/min,毛细管电压1.5kV,干燥温度250℃。1.4.3统计方法2结果2.1加标回收法dpph各萃取组分对dpph自由基的清除效果由表1可知,在DPPH反应体系中,各萃取组分浓度的对数与清除率存在线性关系(P<0.05)。由线性方程得出的抑制50%DPPH时所需浓度(IC50),可以了解普洱茶水提物及其各萃取组分对DPPH自由基的清除效果,其由强到弱依次为PEAF>PBF>PTW>PD>PR。PEAF具有最强的抗氧化性,对该组分进行活性成分的鉴定。2.2黄酮苷类物质的鉴定图2是PEAF的HPLC分析图谱,共有27种成分被分离。表2列出了HPLC图中各个峰的最大吸收波长、MS鉴定结果及被推测的物质。除没食子酸(峰号1)、儿茶素类物质(峰号3、5、6、8、9、13)的鉴定主要基于标样与MS鉴定的分子质量外,其余物质的鉴定主要是通过相关物质的参考文献及MS鉴定推断的。黄酮苷类物质在酸性条件下易失去糖苷基。大多数的黄酮醇糖苷配基都能在总离子流色谱图中被检测到。一些常见的黄酮醇糖苷配基的正离子峰碎片有山奈酚(m/z287)、槲皮素(m/z303)及杨梅素(m/z319)等,通过这些离子峰碎片可推测出PEAF中一些黄酮苷类物质(峰号16、18、25、26、27)。峰号11、12、14、19、21、22、24经鉴定为普洱茶中一些特殊的儿茶素寡聚体,其中峰号11与14分别为黑茶素类化合物———普洱茶素(puerin)B和A,峰号12与22为金鸡纳素Ib(α、β型)。峰号10与20经MS中离子峰碎片鉴定,推测其为表没食子儿茶素-[8,7-e]-4α(β)-(3,4-二羟基苯)-3,4-二氢-2(3H)-吡喃酮的α、β型(相关离子峰碎片m/z分析见图3)。对此物质的鉴定,目前尚未见相关报道。表3列出了PEAF中被推测物质的归属及化学结构。PEAF中多酚类物质大致被分为酚酸类、儿茶素类、儿茶素衍生物、黄酮醇及其糖苷类物质。3酚类物质及抗氧化活性的变化液质联用技术能够将色谱的分离性能与质谱的强定性优势相结合。在分析过程中,首先利用二极管阵列检测器(DAD)初步判断化合物的结构类型,然后由一级质谱给出化合物的准分子离子峰,再结合多级质谱功能,对供试液中未知化合物进行结构预测,推断化合物结构,从而简化了分离、纯化及结构鉴定的过程。二苯基苦基偕腙肼是一种稳定的以氮为中心的自由基,若被测样品能将其清除,则表明其具有降低羟自由基、烷自由基或过氧化自由基的有效浓度及抑制脂质过氧化链反应的作用。目前DPPH测定常用于评估食品或植物提取物的抗氧化活性[12~14]。DPPH有个孤对电子,在517nm处有强吸收,其甲醇溶液呈深紫色。本试验验证了DPPH浓度与其吸光值具有很好的线性关系,回归方程为y=0.0083x(R2=0.988,p<0.01,线性范围0~420μmol/L,x为DPPH浓度,y为吸光值)。普洱茶各萃取组分与DPPH在30min内完全反应并达到稳定状态。普洱茶的乙酸乙酯层在各萃取组分中显示出最强的DPPH清除能力(见表1),这可能与其含有的多酚类物质有关,因此有必要对其多酚类组分进行鉴定。通过部分标样对照、参考相关文献及LC-MS测定,在普洱茶乙酸乙酯层中鉴定出的活性成分大致分为酚酸类、儿茶素类、儿茶素衍生物、黄酮醇及其糖苷类物质。酚酸是一类分子中含有羧基和羟基的芳香族化合物。缩酚酸是由酚酸上的羧基与另一酚酸分子上的羟基相互作用(缩合)而成。从茶叶中已鉴定的酚酸物质为没食子酸、咖啡酸、绿原酸、对香豆酸、鞣花酸、茶没食子酸及鸡纳酸的缩合衍生物等。本试验中鉴定出的酚酸类物质主要为4-羟基苯甲酸、二羟基苯甲酸、没食子酸。这些化合物分别在云南普洱茶原料晒青毛茶、云南省双江县勐库产的普洱茶、沱茶中被检测到。其中没食子酸为重要的酚酸类物质,且普洱茶中没食子酸的含量高于绿茶,这已在作者前期的试验中得到证实。大量的研究已证实儿茶素物质具有较强的清除自由基和抗氧化活性。在晒青毛茶中分离到的儿茶素类物质主要为表儿茶素(EC)、表没食子儿茶素(EGC)、EGCG、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、儿茶素(C)、没食子儿茶素(GC)与表阿福豆素-3-O-没食子酸酯。从云南省双江县勐库产的普洱茶中分离的儿茶素类物质主要为GC、EC、C。从沱茶中分离的儿茶素类物质为EC、C、EGC、EGCG。从云南“生态茶”中分离的儿茶素类物质为C、EC、GC、EGC、ECG、EGCG。在本试验中也鉴定出上述的儿茶素类物质。此外还鉴定出4种特征性的金鸡纳素型氧化黄烷醇类内酯化合物(如普洱茶素A与B等)。这些物质早已从云县普洱茶、沱茶中分离得到,且在晒青毛茶中未检测到黑茶素化合物,推测可能是在渥堆发酵过程中单宁氧化酶和微生物作用的结果。通过LC-MS测定推测普洱茶中可能含有第5种特征性的金鸡纳素型氧化黄烷醇类内酯化合物,即表没食子儿茶素-[8,7-e]-4α(β)-(3,4-二羟基苯)-3,4-二氢-2(3H)-吡喃酮,还有待试验证实。原花青素是由不同数量的儿茶素或表儿茶素结合而成。最简单的原花青素是儿茶素或表儿茶素或儿茶素与表儿茶素形成的二聚体,此外还有三聚体、四聚体等直至十聚体。自从发现葡萄籽提取物——原花青素具有卓越的抗氧化作用后,对儿茶素寡聚体的研究引起了关注。UchidaS.等发现儿茶素的抗氧化活性随着聚合度而递增,对自由基的清除能力:单体<二聚体<三聚体<四聚体,五聚体、六聚体具有强的抗氧化性。在红茶及普洱茶中已鉴定出原花青素类物质(原花色素、原花青色素及原飞燕色素等)的二聚物、三聚物及单、双没食子酸酯。本试验中,在普洱茶的乙酸乙酯层仅检测到原花青素的二聚体(表2中峰号7),推测更大分子质量的聚合物可能存在于普洱茶的其它萃取组分中。目前从绿茶及红茶中分别鉴定出20种黄酮醇及其糖苷类物质。这些化合物包括山奈素、槲皮素、异槲皮素、杨梅素及其单、双、三糖苷(半乳糖苷、鼠李糖苷及葡糖苷等)类物质[19~21]。黄酮苷被认为是绿茶汤色的重要组分。黄酮醇苷水解时得到的糖有葡萄糖、鼠李糖、半乳糖和芸香糖等。苷类化合物的水溶液有苦味,水解成苷元和糖体后苦味消失。黄酮类物质色黄,氧化产物为橙黄色以至棕红色,此类物质及其氧化产物对红茶茶汤的色泽与滋味都有一定的影响。另有研究证实绿茶中一些黄酮醇糖苷类物质在护肝功效中发挥了一定的作用[22~23]。本试验中,在普洱茶中鉴定出的黄酮醇及其糖苷类物质,包括山奈素、槲皮素及其单、双、三糖苷类物质(见表2、表3)。与云南省双江县勐库产的普洱茶相比,未检测到杨梅素及其糖苷类物质。以上的试验结果提示不同来源的普洱茶的化学成分有明显的差异,这可能是由于原料产地、制作工艺等不同引起的。比较从普洱茶中分离到的化合物的抗氧化活性可知,儿茶素类物质与简单酚类化合物(没食子酸等)具有较高活性,黄酮类化合物次之,黄酮苷类物质活性较差。因此表明了儿茶素与没食子酸在普洱茶的抗氧化活性中起着重要的作用。同时发现其结构中苯环上有邻位羟基的化合物,其清除自由基的活性较强,且羟基越多活性越强。上述研究对各个化合物之间的自由基清除能力(IC50)作了比较,揭示了普洱茶中哪些化合物具有抗氧化活性。至于谁对普洱茶的抗氧化功效贡献最大,还有待于进一步的研究。普洱茶的一些特殊保健功能可能与存在的特异多酚类物质如儿茶素的寡聚体等相关。本课题组曾报道在普洱茶乙酸乙酯萃取层中分离出的E8层,在清除羟自由基、超氧阴离子能力及其对H2O2诱导HPF-1细胞损伤的保护作用方面均强于EGCG,同时在E8层中