利用第一腹肢移植雌青蟹纳精囊的研究

利用第一腹肢移植雌青蟹纳精囊的研究

蟹类人工繁殖是综合育种、雌性育种、精细诱导育种、二型育种分类等基础。它也是研究甲壳动物精神器特征的有效手段。有两种收割技术，即外部人工精细和内科医生。关于甲壳动物的人工育种问题，clark等人在1973年取得了一些进展。然而，由于难以理解卵的生理成熟的技术问题，以及卵离体培养的困难，即使在生产上也很难形成规模。persyn（1977）成功移植后代。已有的蟹类人工授精都是体外受精,对于蟹类精荚移植的体内人工授精,国内外则无相关报道.本文首次报道锯缘青蟹(Scyllaserrata)体内人工授精的初步实验结果,并对其进一步研究作了展望.1材料和方法1.1青蟹及精荚的人工移植培养青蟹于2001年7至10月和2002年7至10月购自厦门水产市场,选取健康,性腺发育饱满青蟹及部分未成熟青蟹,用于精荚的人工移植研究.青蟹饲养于厦门五通1m3的4口小培育池中,实验用水采用二级沙滤,硅藻土过滤.1.2传统拉制器推制模仿青蟹雄性第一腹肢,根据其在交配中的作用机理,采用常规滴管为材料,利用酒精灯灼热拉制一个前端弯曲、侧扁、管径大小相近的人工交配器(图1).1.3青蟹人工授精缓冲液采用无钙离子的人工海水(Ca2+-FSW)(Leung-Trujillo&Lawrence,1987)作为青蟹人工授精的缓冲液.缓冲液中加入适量庆大霉素.缓冲液主要用于稀释、保护精液和冲洗器具.1.4青蟹精荚的提取精荚人工移植时采用1∶1的性别配比,挑取成熟的雄性青蟹,解剖获取贮精囊处的精荚.精荚在用Ca2+-FSW配制的庆大霉素液中轻微漂洗,然后放于1.5cm3的离心管中.同时吸取200μm3左右的上述缓冲液于每一个离心管中.用另一只滴管头挤压贮精囊壁,释放精荚中的精子使其呈游离状.同时迅速将雌蟹腹部打开,用庆大霉素液冲洗阴道开口表面.将人工交配器插入阴道开口处适当深度,立即吸取精荚或精液滴入人工交配器中,马上用洗耳球吹气,推进精荚及精液于纳精囊中.整个过程在3～5min内完成,需两人协作.青蟹人工授精完成后干露放置一段时间,再放于池中.1.5青蟹的覆盖人工授精蟹的培育池底用砖块在中间分隔,一半铺沙,另一半空出.在池底铺沙部分靠墙侧搭建多个蟹窝.每天投饵于没有铺沙处,饵料主要以杂色蛤为主,投饵量视青蟹摄食状况而定.保持水质的清新,隔天排换水1次,排完水后要干露1～2h,再加水.同时取适量海边滩泥于池中,减少水的透明度.青蟹产卵后,从培育池中及时将抱卵蟹转移到大的圆形孵化桶中,开口用泡沫板覆盖.移入前用50mg/dm3高锰酸钾浸泡15～20min.不投饵,保证定期换水和冲气量,定期检查胚胎发育状况.2结果2.1亲蟹产卵及胚胎发育情况单边纳精囊人工植入精荚,三组实验除因实验操作或运输不当而使青蟹死亡的外,共计14只青蟹,其中有8只青蟹产卵(表1).同时与自然交配的亲蟹产卵情况进行对比,自然交配的亲蟹总数为8只,其中有6只在短期内正常产卵,表2记录了自然交配的3只蟹产卵及胚胎发育情况.两者对比最明显的差异是人工授精的亲蟹的抱卵量低于正常交配蟹抱卵量,约为后者的1/3～1/2左右.镜检纳精囊发现两边的精子基本保持完整,植入精荚的一边含有较多的细菌和原生动物,部分精子受渗透压作用已呈膨大状.2.2亲蟹和未成蟹的产卵和生长2002年8～10月挑选性成熟的青蟹及未交配但接近性成熟的青蟹进行实验,性成熟亲蟹双边纳精囊植入精荚,3只青蟹成功产卵.而12只未交配的蟹,未能成功产卵,但授精后一直维持着较高的活力,大都因为长期养殖,营养和水环境恶化导致细菌感染,脱皮不遂引起死亡.2.3精荚移植后的纳精囊形态变化人工授精后的青蟹纳精囊发生强烈反应.无论是未交配性腺不成熟雌蟹,还是性成熟雌蟹,纳精囊都会产生黑色素物质.组织学研究表明黑色素物质为均质的嗜曙红分泌物,不成熟雌蟹含量较多.精液颗粒大部分被黑色素分泌物溶解,少量被挤压至纳精囊一边[(图版Ⅰ-1)附在刊末,下同].精荚和精液移植到性腺未成熟的青蟹中,精液基本不会分解(图版Ⅰ-3),精荚被纳精囊上皮大量吞噬.另有大量精荚游离在腔中不被裂解(图版Ⅰ-5).采用2∶1雄雌比移植的精荚量远不如自然交配输入的精荚量.一个特殊现象是不成熟蟹精荚移植两个月后,上皮内吞的精荚会进入到纳精囊外周的动脉中.部分发生在阴道部,阴道上皮增生(图版Ⅰ-7),尤其是会进入到支配纳精囊的主干神经的神经下动脉中(图版Ⅰ-8).精荚移植到性腺成熟青蟹中,大部分被裂解并消化,和原有精液颗粒混合在一起.性腺成熟青蟹移植的精荚大部分裂解,少量保持完整状态,移植精液和精荚能够进入到输卵管处(图版Ⅰ-2,图版Ⅰ-4).性腺成熟青蟹精荚移植后的纳精囊上皮脱皮严重,部分上皮细胞充满大量分泌物(图版Ⅰ-6).3讨论3.1蟹类精荚的移植利用昆虫人工授精的原理,本实验首次实现了蟹类精荚的人工移植,但没能真正实现蟹类精荚移植人工授精的成功.在具封闭型纳精囊虾类脱皮间期或雌体还很软时,精荚可以移植.蟹类自然交配一般是在雌蟹完成生殖脱壳后的几天时间内完成.但有些蟹存在硬壳交配的现象,包括多次抱卵的雌蟹和初次抱卵的雌蟹.雌美洲螯龙虾(Homarusamericanus)脱皮24h后一般不接受交配,如果交配,产卵结果并不理想.与中华绒螯蟹管状的交配器不同,青蟹的交配器很长,以利于人工授精,这是进行青蟹人工授精工作的优势.3.2精荚的人工移植甲壳动物人工授精在虾类中取得了许多突破,实现了精荚电刺激人工排放.蟹类精荚的移植相对于虾类是有更大困难的,主要在于两者生殖系统结构上存在着较大的差异.首先同为十足目的蟹类和对虾类的精荚具有很大差异.对虾精荚表现出形态的多样性,它的复杂性和纳精囊类型密切相关.纳精囊属于开放型的虾类有一个复合的精荚,受精时从一对输精管末端壶腹排出后,组装成豆形精荚.与纳精囊属于开放型的虾类精荚的高度复杂结构相对,纳精囊属于封闭型的虾类的精荚不太复杂.主要由两个基本部分组成,分别是主体和翼或副翼.两种类型纳精囊虾类的精荚都是精液和精子团的复合体.而蟹类生产甲壳动物中最简单的精荚,精荚和精液是分离的,精荚中仅含有精子和精荚壁延伸入内部形成的精荚基质.精荚由颗粒状精液的流动介质携带.因此虾的精荚含有虾雄性亲体完全的产物,即精荚中含有精子及精液,不同于蟹类两者分开的状况,而且虾类精荚形成于生殖管末端,含有完全的雄性生殖管的分泌物,人工授精基本等同于自然授精,因为两者都可以将雄性产物完全转移到雌体.其次本实验中精荚人工移植时,采用的仅为青蟹贮精囊中的精荚及精液颗粒.在青蟹贮精囊后部,还有相当于副性腺的射精管,其分泌大量的抗菌物质.青蟹射精管后端还存在促雄腺结构,其主要分泌产物,可能对精荚发生或如昆虫的副性腺一样对雌体存在很大影响.除此之外,射精时增加的雄性产物还有交配器皮腺(GTG)的分泌物.另外,据研究昆虫精子抗菌作用只有在交配时才能激发.因此从纳精囊中取得的精子可能不具备抗菌功能,射精管的分泌物具有抗菌功能,在没有射精管分泌物情况下,进行精荚的人工移植,难以保证精子在纳精囊中的存活.本实验中,仅将贮精囊中的精液及精荚移植到雌体,而没有采集射精管中的液状精液,这部分精液在短时间较难收集.对雄性生殖系统结构研究表明,射精管分泌物还起到液化颗粒状精液的作用.哺乳动物的精液的液化很重要,精液不充分液化时,其中的精子是不具受精能力的.本实验人工授精没有成功,一个原因可能是因为没有射精管中分泌物的参与,颗粒状精液不能正常液化所致.另外蟹的人工授精研究很少,是因为蟹属于真正的体内授精.纳精囊为封闭型虾类,也是体内受精,但是因为虾纳精囊的开口很浅,不存在如蟹类明显的阴道结构,因而易于进行精荚的人工移植.比如,王清印等(1989)采用对虾输精管进行人工授精时,用一特制的弯曲的、尖头向两侧弯曲的小镊子就可以轻易的将输精管送入纳精囊中.相反,蟹类具有长长的阴道,需要人工交配器才能进行人工授精.人工交配器如果拉制不好,将会对阴道组织造成破坏.实验中曾因交配器尖端撞断,强行对不成熟雌蟹进行了精荚移植的人工授精,这批雌蟹在两周内相继死亡,同时对成熟雌蟹的产卵量也有很大的影响.3.3纳精囊的作用青蟹精荚人工移植实验发现,除液化或完整的精液颗粒外,精荚能够内吞进入纳精囊的腺质上皮.雄性产物进入纳精囊,对雌体生殖行为及生理上的作用,在甲壳动物中还没有具体的研究.和本实验人工移植精荚被纳精囊上皮内吞,部分能进入外周的血管腔中一样.昆虫中有较多关于雌体纳精囊分泌物对精子有吸引作用及精荚的降解作用的研究.果蝇精液蛋白能够通过阴道后壁进入交配雌体的血液循环系统.阴道后壁和生殖管其它部位不一样,缺乏肌肉,通透性较强,有助于物质进入循环系统.东亚飞蝗(Locustamigratoria)纳精囊除了分泌产物到纳精囊腔中外,腔中物质也能进入上皮,例如精荚的降解产物可以进入到纳精囊中.东亚飞蝗交配时雄性副性腺产物也能够进入到纳精囊中,例如:能够诱导纳精囊收缩的LOM-AG-MyotropinⅡ因子或产卵刺激因子.这些物质能够克服纳精囊上皮的限制,进入上皮细胞,以发挥作用,在没有任何感觉毛传导信息的情况下,也影响生殖行为.3.4青蟹和纳精囊的优化研究对于蟹类精荚人工移植的授精还需要进一步深入研究,同时进一步优化授精过程中的各个环节.如需要采用新式材料代替玻璃,如在蜜蜂人工授精中常用的聚乙烯材料,来打制一个更适合蟹类雌性生殖道及其生理需求的人工交配器.同时需要研究青蟹的人工精浆.实验中采用磷酸钙液介异精子转基因时的失败,证明了合适缓冲液的重要性.而采用的Ca2+-FSW虽能保证纳精囊精子的活力,还需优化.生理液主要用于稀释、保护精液和冲洗器具.生理液有效成分的浓度、溶液的pH等均可影响精子的活力和授精效果.因此,生理液的配制要求十分严格.青蟹的人工精桨不仅要考虑到无机离子含量及相应的渗透压要求,同时要对精子全面营养的需求进行研究.特别是对