雪白根霉脂肪酶基因在毕赤酵母中的高效表达及其酶学性质研究

PAGE——————珠海市科技攻关及高新技术产业化（2012D0201990042）雪白根霉脂肪酶基因在毕赤酵母中的高效表达及其酶学性质研究王建荣，刘丹妮，李鹏，刘金山，周平发，陈丽芝，聂金梅，钟开兴，李阳源*（广东溢多利生物科技股份有限公司，广东珠海，519060）摘要：采用同源克隆法获得了雪白根霉的脂肪酶基因（rnl），将其连接到pPICZαA载体上，得到重组表达载体pPICZαA-rnl。将表达载体pPICZαA-rnl用限制性内切酶SacI线性化后，电击转入毕赤酵母X-33中。雪白根霉脂肪酶基因在毕赤酵母X-33中成功表达，重组菌株摇瓶培养144h后，酶活可达48U/mL。重组酶最适pH值为8.5，最适反应温度为35℃。1mmol/L的Mn2+,Ca2+和K+以及1%的表面活性剂吐温20，吐温80，曲通100对重组脂肪酶具有激活作用。重组酶的最适底物为三月桂酸甘油酯（C12）关键词：雪白根霉，脂肪酶，毕赤酵母X-33脂肪酶（Lipase，E.C.），全称为三酰基甘油酰水解酶（triacylglycerolacylhydrolase），它属于α/β折叠酶家族，是一种丝氨酸水解酶。脂肪酶可以在油水界面上催化天然底物油脂水解,释放更少酯键的甘油酯或甘油及脂肪酸，而在非水相体系中脂肪酶还可催化转酯和酯合成等多种反应[1]。脂肪酶作为一种重要的工业酶被广泛的应用到食品加工、洗涤、医药等领域。脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中，相对于动植物，微生物分泌的脂肪酶具有很多的优势：如微生物分泌的脂肪酶一般都为胞外酶，更适合工业化大生产；微生物来源的脂肪酶具有更广的作用温度范围、作用pH以及底物专一性[2-3]。随着国内外对脂肪酶研究的深入，越来越多的微生物脂肪酶被发掘出来。微生物脂肪酶主要分为细菌脂肪酶和真菌脂肪酶两大类，细菌脂肪酶研究较多的是假单胞菌属脂肪酶[4]，真菌脂肪酶的研究主要集中在根霉属和酵母属两大类[5-6]。相对于其他微生物来源的脂肪酶，根霉属脂肪酶具有高度的1、3位置专一性和立体选择性。在根霉脂肪酶中，来源于米根霉的脂肪酶被广泛应用于生物柴油的生产[7-8]；来源于华根霉的脂肪酶主要应用于烘焙食品、有机合成等领域[9-10]；相对于以上两种根霉脂肪酶，雪白根霉脂肪酶主要应用于油脂加工、改性等领域[11-12]。为了进一步提高雪白根霉脂肪酶（RNL）的酶活及改善其酶学性质，许多学者开始应用分子生物学的方法研究其脂肪酶基因的克隆、表达、调控等。迄今，雪白根霉脂肪酶基因已经在酿酒酵母中实现了异源表达[13]。相对于酿酒酵母表达系统，毕赤酵母表达系统具有更多的优势：培养条件简单、易于操作便于工业化生产；高稳定性表达，可高效的表达外源蛋白等[14]。到目前为止，还没有关于雪白根霉脂肪酶基因在毕赤酵母进行表达的研究报道。本研究首次将雪白根霉脂肪酶基因在毕赤酵母中进行了异源表达并且测定了重组雪白根霉脂肪酶（RNL）的酶学性质，为下一步对雪白根霉脂肪酶基因进行基因改造以及高密度发酵重组雪白根霉脂肪酶酵母工程菌奠定基础。1.材料与方法1.1材料与试剂表达载体pPICZαA、毕赤酵母X-33，博莱霉素，购自美国Invitrogen公司。大肠杆菌Top10，高保真Pfu酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶EcoRI、XbaI、质粒提取试剂盒、真菌基因组提取试剂盒、PCR纯化试剂，购自上海生工公司；不同碳链长度的脂肪酶底物，购自美国Sigma公司；其他常规试剂均为国产分析纯或进口分装；引物由深圳华大基因合成。大肠杆菌用LB培养基进行培养，酵母转化子分别用YPDZ和罗丹明B培养基进行筛选，酵母摇瓶培养及产酶培养基分别为BMGY和BMMY。LB、YPDZ、BMGY和BMMY培养基分别参照Invitrogen公司的酵母表达手册进行配置。罗丹明B培养基的配方为：在YPD培养基的基础上加入2×10-4%（w/v）的罗丹明B和1%（v/v）的橄榄油。1.2仪器与设备PCR仪、凝胶成像系统、冷冻离心机，珠海黑马科技有限公司；电穿孔仪，美国Bio-Rad公司；脂肪酶活性测定酸碱滴定仪，瑞士Metrohm公司；1.3雪白根霉脂肪酶基因克隆及表达载体的构建1.3.1雪白根霉基因组DNA的提取挑取雪白根霉菌丝体，接入50mLPDA液体培养基中，30℃，200r/min培养3天，离心取菌体，参照真菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA。用微量紫外分光光度计测定DNA的浓度，选取A260/A280值在1.8~2.0的样品于-201.3.2雪白根霉脂肪酶基因克隆据文献报道[13]，雪白根霉的脂肪酶基因不含有内含子，因此可以以雪白根霉的基因组DNA为模板，通过PCR的方法扩增rnl。经过分析NCBI上已报道的rnl的全基因组DNA序列（Genebank登录号为：AB013496），设计了一对引物，上游引物：5'-CAGCGAATTCATGGTTTCATTCATTTCCATT-3'和下游引物：5'-GACGTCTAGATTACAAACAGCTTCCTTCGTT-3'（分别含有EcoRI和XbaI酶切位点）。以提取的雪白根霉基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系：DNA模板1μL（约50ng），上、下游引物各2μL，2×PfuMasterMix50μL，用ddH2O补充到总体积为100μL。PCR反应条件：94℃预变性4min后，分别于94℃变性30s，58℃退火30s和72℃1.3.3表达载体pPICzαA-rnl的构建pPICzαA质粒和目的基因PCR产物都用EcoRI和XbaI进行双酶切，切胶纯化后，用T4DNA连接酶16℃过夜连接酶切产物，然后用CaCl2转化法转入E.coliTop10，在含251.4转化毕赤酵母以及高酶活转化子的筛选1.4.1重组毕赤酵母的构建重组质粒用限制性内切酶SacI进行线性化后，使用电转化法转化到毕赤酵母X-33，取转化产物涂布于含有100μg/mL的ZeocinYPD平板上，30℃1.4.2高酶活转化子的筛选将YPDZ平板上的酵母转化子，分别挑入每个孔含有1mLBMGY的24孔板中，过夜培养，离心倒掉上清，每个孔中加入1mLBMMY培养基，诱导培养24h后，离心，取上清。分别取10μL上清酶液加入已打好孔的罗丹明B筛选平板。35℃1.5重组酵母工程菌的摇瓶培养、酶活测定、酶蛋白的纯化和SDS电泳分析1.5.1重组酵母菌摇瓶培养及酶活测定将筛选出的高酶活转化子，接种于含有50mLBMGY培养基的500mL三角瓶中，30℃，250r/min振荡过夜培养至OD600达到2~6。离心收集菌体，再将其重悬浮于BMMY培养基中，稀释至OD600为1.0，继续振荡培养，每隔24h向BMMY培养基中补加甲醇至终浓度为0.75%进行诱导表达，同时测定重组菌的菌体浓度和脂肪酶酶活。脂肪酶活性测定参照报道的方法进行[15]1.5.2RNL重组蛋白的纯化和SDS电泳RNL重组蛋白的纯化参照报道的方法进行[16]。将发酵液离心取上清，上清即为粗酶液；将粗酶液进行超滤浓缩，超滤膜的截流分子量为10kDa；将超滤后的酶液进行SP-sepharoseFastFlow离子交换层析，收集有酶活力的洗脱峰，经透析浓缩后作为SDS上样液。电泳采用12%的分离胶和5%的浓缩胶，电压控制在40V。电泳结束后进行考马斯亮蓝染色。1.6重组RNL的酶学性质1.6.1最适pH及pH稳定性在35℃、不同pH（6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10）条件下测定重组RNL的活性，以活性最高时pH值下的酶活为100%，计算其它pH值条件下的相对酶活。将重组RNL分别在pH3-11（缓冲液体系分别为：pH3-7为100mM的柠檬酸-磷酸钠缓冲液；pH8-9为100mM的Tris-HCL缓冲液；pH10-11为100mM的NaHCO3缓冲液），25℃1.6.2最适反应温度及耐温性在pH8.5条件下测定重组RNL在25-50℃不同温度下的酶活，以测定酶活最高时温度下的酶活为100%，计算其它温度下的相对酶活。将重组RNL在不同温度下(30-701.6.3金属离子及表面活性剂对重组RNL活性的影响在含有1mmol/L不同金属离子以及1%不同表面活性剂的环境中，将重组RNL在25℃1.6.4重组RNL底物特异性在pH8.5，35℃条件下分别测定重组RNL对不同碳链长度的脂肪酸甘油酯以及不同脂肪酸2结果和分析2.1表达载体pPICzαA-rnl的构建以提取的雪白根霉基因组DNA为模板，用设计好的引物进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳可见PCR产物大小约为1200bp（图1）。将该目的片段回收并克隆到表达载体pPICzαA，提取重组质粒，用限制性内切酶EcoRI和XbaI进行双酶切鉴定，电泳结果显示片段大小正确（图1），测序结果表明RNL基因全长为1179bp，起始和终止密码子分别为ATG和TAA，以上实验结果表明：表达载体pPICzαA-rnl构建成功。M：DNAmarker;1：脂肪酶基因PCR扩增产物；2：重组质粒pPICzαA-rnl的酶切鉴定图1脂肪酶基因PCR扩增及重组质粒酶切鉴定Fig.1ElectrophoretogromofPCRandrestrictionenzymeanalysisofplasmidpPICzαA-rnl2.2重组毕赤酵母的构建以及高酶活转化子的筛选表达载体pPICzαA-rnl经SacI线性化后，电转入毕赤酵母X-33，涂布在Zeocin抗性平板上，30℃，培养3-4天后长出数百个转化子（图2A）。按照方法1.4.2挑取96个转化子进行培养，通过罗丹明B平板进行筛选，由图2B可以看出不同转化子的上清酶液所产生的荧光圈的大小不同，根据荧光圈的大小选择R1，R2和R3这三图2酵母拟转化子（A）及罗丹明B平板筛选（B）Fig.2Putativetransformants(A)andscreeningoftransformantsbyrhodamineBmediumplates(B)2.3重组转化子脂肪酶基因的诱导表达及酶活测定将筛选出的高酶活转化子R1，R2和R3，按照方法1.5.1进行诱导培养，每隔24h取样测量菌体浓度和上清发酵液的酶活。经过比较分析，转化子R3的重组酶活最高，其发酵曲线如图3所示：诱导到144h时，菌体浓度和酶活均达到最大值，其中菌体的OD值为44，酶活为48U/mL。图3重组毕赤酵母产酶曲线和生长曲线Fig.3Cellgrowthandlipaseproductionofrecombinantyeast2.4SDS分析将纯化后的重组RNL进行SDS-PAGE分析。由图4可知，重组酶分子质量约32kD，这与经ExPASyProteomicsServer软件对重组RNL的氨基酸序列进行分子质量预测值接近。M：蛋白Marker；1：超滤后的重组RNL；2：经SP-sepharoseFastFlow离子交换层析后的重组RNL图4重组RNL的SDS分析Fig.4SDSanalysisoftherecombinantlipase2.5重组RNL的酶学性质2.5.1重组RNL的最适pH及pH稳定性在35℃，不同pH条件下测定重组RNL的酶活，实验结果见图5A。从图5A可以看出在pH6-8.5范围内，随着pH值的升高酶活也逐渐升高，在pH8.5-10范围内重组RNL的活性逐渐下降，说明重组RNL的最适pH值为8.5。将重组RNL在不同pH条件下室温保存24图5重组脂肪酶的最适反应pH值（A）及pH稳定性(B)Fig.5EffectofpHonactivityandstabilityoftherecombinantlipase2.5.2重组RNL的最适反应温度及热稳定性在pH8.5条件下，分别在不同温度下测定重组RNL的酶活，实验结果见图6。由图6可知：在30-35℃范围内重组RNL的酶活逐渐上升，在35-70℃范围内重组RNL的酶活逐渐下降，说明重组RNL的最适反应温度为35℃。耐温性方面：将重组RNL分别在30-70℃水浴保温10min，再在最适反应条件下测定剩余酶活。实验结果表明：在30-50℃范围内，重组RNL具有较好的稳定性，剩余酶活可达到75%以上；当温度超过55图6重组脂肪酶最适反应温度及热稳定性Fig.6Effectoftemperatureonactivityandstabilityoftherecombinantlipase2.5.3金属离子及表面活性剂对重组RNL活性的影响金属离子对重组RNL活性的影响见表1。由表1可知，1mmol/L的Mn2+、Ca2+和K+对重组RNL具有激活作用，相比对照分别提高8%、8%和25%。除了Mg2+其他金属离子对重组RNL活性的影响较小，剩余酶活都在83%-100%之间。表2结果显示：1%含量的吐温80、吐温20以及曲通100对重组RNL具有激活作用，活性分别提高52%、36%和26%。SDS对重组RNL具有较强的抑制作用，当SDS含量为1%的情况下重组RNL的酶活减少到只有对照的30%。表1不同金属离子对重组脂肪酶活性的影响Table1Effectofdifferentmetalionsonactivityoftherecombinantlipase金属离子对照Mn2+Li+Co2+Cu2+Ca2+Mg2+K+Na+Zn2+Fe3+相对酶活（%）1001088310092108561259210092表2表面活性剂对重组脂肪酶活性的影响Table2Effectofdifferentchemicalsonactivityoftherecombinantlipase表面活性试剂对照SDS吐温80吐温20曲通100相对酶活（%）100401521361262.5.4重组脂肪酶的底物特异性重组RNL对不同底物的活性见表3，由表3可知重组RNL对长碳链底物的活性高于短碳链的底物。脂肪酸甘油酯方面，重组RNL的最适底物为三月桂酸甘油酯（C12），其次对三棕榈酸甘油酯（C16）的活性较高；脂肪酸甲酯方面，重组RNL对月桂酸甲酯（C12）的活性最高，其次是棕榈酸甲酯（C16）。表3重组脂肪酶的底物特异性Table2Substratespecificityoftherecombinantlipase底物相对酶活（%）三丁酸甘油酯（C4）36三辛酸甘油酯（C8）45三月桂酸甘油酯（C12）100三棕榈酸甘油酯（C16）65三硬脂酸甘油酯（C18）55丁酸甲酯（C4）6辛酸甲酯（C8）11月桂酸甲酯（C12）25棕榈酸甲酯（C16）15硬脂酸甲酯（C18）153结论本文从雪白根霉中克隆得到一个脂肪酶基因，并将该基因和酵母表达载体pPICzαA连接，构建了酵母表达质粒pPICzαA-rnl。将重组质粒转化至毕赤酵母X-33，经过YPDZ、罗丹明B平板筛选和摇瓶筛选，最终得到一株高表达重组RNL的酵母工程菌，该重组酵母工程菌在摇瓶培养条件下酶活最高可达48U/mL。通过超滤以及SP-sepharoseFastFlow离子交换层析从发酵液中得到纯化的重组RNL。酶学性质研究表明：重组RNL的最适反应pH值和温度分别为8.5和35℃并且在pH5-10以及30-50℃范围内具有较好的稳定性；1mmol/L的金属离子Mn2+、Ca2+和K+对重组RNL具有激活作用，而Mg2+对重组RNL具有一定的抑制作用；1%的表面活性剂吐温80、吐温20以及曲通100均对重组RNL具有激活作用，比对照分别提高52%、36%和26%；重组RNL在底物特异性方面偏爱于长碳链的底物参考文献[1]JaegerKE,EggertT.Lipases

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