利用基因组技术生产转基因动物的基因打靶技术

利用基因组技术生产转基因动物的基因打靶技术

将一些dna段插入动物细胞后，它们可以定位并与内源级同源序列进行重组。这种基因重组被称为基因问题。基因打靶技术可以用来生产转基因动物。在小鼠胚胎干细胞中应用这一技术已生产出各种不同基因位点的突变体,可对小鼠中特异性基因的表型进行评价。基因打靶技术不只是一种使基因失活的手段,而且可作为一种用来改变基因活性的方法。1基于dna的同源重组第1个携带有外源性基因的动物是将逆转录病毒——猿猴病毒40(SV40)DNA注射到小鼠的胚泡腔中产生的,但这些小鼠并没有将SV40DNA整合到它们的生殖细胞中。第1次基因打靶实验是用一种可选择的人工位点的成纤维细胞系进行的。在小鼠中,已做了大量的工作,并产生了各种突变体,另外,也有人通过使用纯化基因DNA而使同源重组的效率提高。虽然,已经证明未经纯化的DNA同样成功的在小鼠胚胎干细胞和小鼠体细胞中进行打靶,但是很明显的使用基因纯化的DNA时,重组的效率得到了很大的提高。纯化基因DNA,即同被打靶的DNA具有100%,这在高度近交的实验小鼠中并不是问题,但对于所有种类的远交家畜来说,确是至关重要的一个问题。为了克服这一问题,维持打靶基因的纯化率,依赖于一种long-rangePCR技术,这一技术基于DNA聚合酶的重组,能产生35kb大的扩增子,比同源化的长度更重要的是酶的正确性相当的高,要达到错误率仅为1bp/100kb。有人发现Pfu1作为一种编辑和纠正的酶,错误率可以控制在可接受的范围内。但是对于纯化基因片段产生的实际速度和难易程度来说,还依靠对于想要的基因所知的序列信息量。2基因冲突法适用于大型动物2.1核移植体的基因敲除增强绿色荧光蛋白基因(EGFP)比野生型GFP基因更适合用来作为一种报道基因,因为野生型的GFP基因在哺乳动物细胞中表达水平很低,EGFP的表达可在活细胞中被检测到,所以,有人将EGFP基因和NeoR通过一种逆转录病毒载体系统转化到猪胎儿成纤维细胞中,转染的猪胎儿成纤维细胞经过核移植后,构建的胚胎成功的发育到胚泡期。这些胚胎在2细胞,4细胞,桑葚胚及胚泡期的细胞质中表达EGFP,并且没有镶嵌现象,这一结果也说明了EGFP基因可以作为一种识别胚胎移植前的转基因核移植后的猪胚胎的标志物。有人将胎儿来源的成纤维细胞用含有EGFP的复制缺陷型载体进行转染,转染后的细胞用秋水仙素进行处理(秋水仙素-使细胞同步进入G2/M期),然后将这些细胞作为核供体进行核移植,将细胞核注射到体外成熟的去核的猪卵母细胞的卵周隙中,融合并用电脉冲激活。融合后2小时,在大多数的重构卵中均可检测到荧光。在所有的核移植胚胎中,融合后15小时荧光变弱,当培养到48h后,荧光消失,但从第3天起,在2细胞,4细胞时期的胚胎中又开始表达EGFP。将200个1细胞时期的重构胚移植到4只受体中,其中有3只动物怀孕,并且有1只受体猪产下1个健康的表达EGFP的转基因后代。在猪向灵长类动物进行器官移植的过程中,存在着的主要的障碍就是猪细胞表面的末端1,3半乳糖基(Gal)使异源移植过程中发生免疫排斥反应,导致失败的器官移植。为了能够克服在异源移植过程中由于Gal的存在而引起的排斥反应,赖良学等人通过敲除1,3半乳糖基转移酶(GGTA1)位点而产生了4头此基因被敲除的猪。1,3半乳糖基转移酶(GGTA1)位点的敲除可以提供永久的和完全的保护。通过胚胎干细胞工程成功的获得了此基因被敲除的小鼠,但对于有些家畜来说,还不能轻易的获得ES细胞,所以,体细胞核移植技术的发展为在大动物中进行基因的定点修饰提供了可能。在这一实验中,研究者选择在一高度近交的主要组织相容性复合体限定的小型猪系中进行GGTA1位点的敲除,这样大小的猪对于进行临床的器官移植非常适合。用一种基因捕获打靶载体pGalGT来对一内源性的GGTA1等位基因进行同源的置换,载体包含有约21kb大小的与GGTA1位点同源的序列,对17个克隆进行分析后,发现有8个包含有想象中的重组事件。获得的这几头基因敲除猪是利用了核移植技术,选择经过基因修饰过的克隆的胎儿成纤维细胞系作为核的供体,与去核的猪卵母细胞进行胚胎的构建。也有人用以一种细菌毒素为基础的选择过程来筛选细胞,在这些细胞中,Gal基因的第2个等位基因被敲除掉。序列分析显示,Gal基因的第2个等位基因的敲除是由于1个在外显子9的第2个碱基上的T到G的单个位点突变引起的,这可以导致Gal蛋白的活性丧失,通过3轮连续的克隆获得4只健康的Gal1、3GT双敲除的雌性小猪。还有人用2种其他的方法成功的产生出了GalT+/-的猪胎儿成纤维细胞。一种是用一基因纯化的打靶构建体进行的正的阴性选择物,另一种是使用带有非纯化DNA的无启动子载体。迷你型猪由于它的体型小,以及与人在生理上具有某种相似性,对于医学和药理学的研究意义重大,所以对于转基因的迷你型猪的研究也就变得很有价值了。首次成功的报道转基因迷你型猪的获得是通过原核显微注射的方法实现的,从迷你型猪克隆得到的huntingtin基因与大鼠的神经元特异性的烯醇化酶的启动子区域相结合,通过显微操作仪注射到受精卵的原核中,将受精卵再移植到这种猪的输卵管中,通过PCR和Southern分析,成功的产出了5只具有转基因特性的后代。2.2-actingfp的电融合与同源重组经过基因修饰后的牛具有重要的农业和人类医药价值。有人用体外培养的转基因的胎儿细胞系进行核移植,成功的获得了后代小牛,这证明了产生转基因克隆牛的可能性,并且用成体的颗粒细胞作为核供体进行移植也同样能成功的产生克隆牛,所以有人也尝试用此细胞类型来产生转基因的克隆牛。他们将一含有EGFP基因的质粒转染细胞,核移植后的胚胎可以发育到胚泡期,并且通过研究发现,晚期的转基因成体细胞要比早期细胞更适合作为核供体。已知所有物种中的精子细胞都可以结合蛋白和DNA,因此,能用它们来作为载体,将外源的DNA在受精过程中导入卵母细胞中,外源DNA既能整合到精子染色体DNA中,又能通过精子转导到卵中,并且随后可整合到受精卵的基因组中。有人将牛的精子与Pst1β-actinGFPDNA构建体进行电融合,这样能将这段DNA转化到体外受精后的胚胎中。研究发现,电融合的过程本身并不影响体外胚胎的发育,然而,经过电融合的DNA处理的精子进行受精后的卵母细胞发育到16细胞时期的比例却相当的低。但另一方面,电融合的使用可大大提高DNA的吸收。通过PCR检测得出结论,电融合后发生同源重组的效率要远远高于非电融合后的同源重组。用限制型性内切酶介导的基因插入方法能获得转基因的牛精子,即用Not1-线性化的pEGFP和其相关的限制性酶对牛的精子细胞进行脂质转染。将目的片段整合到精子基因组DNA中,然后用这种精子进行体外受精,产生的桑葚胚能够表达GFP。当将转基因的精子用来做人工授精时,产生的小牛在它们的淋巴细胞中检测到外源DNA的表达。结果显示,限制性内切酶介导的基因插入是一种产生转基因精子,通过人工授精产生后代或通过体外受精产生胚胎的有效方法。将哺乳动物的人工染色体导入受精卵中是一种可行的且更有前景的产生重组蛋白的方法。哺乳动物人工染色体可以沿着受体染色体复制,而不会整合到同源的基因组中,并且有能力运载大量的经过设计后的带有调节区域的DNA片段,这种调节区域可以使基因进行组织特异性和长时间的表达。有人将人工的染色体显微注射到体外成熟后体外受精的受精卵的原核中,人工染色体携带有LacZ基因或绿荧光蛋白基因,孵化的胚胎在封闭的STO细胞饲养层上培养。结果发现,人工染色体导入牛受精卵中,也可以使胚泡继续发育,并且报道基因的表达一直可维持整个着床前的发育过程。同样,在牛中,也有人将EGFP作为报道基因,与核移植技术相结合来产生转基因的牛胚胎。将pCXNeo-EGFP构建体显微注射到牛的体外成熟-体外受精的受精卵的原核中,大多数表达EGFP信号的胚胎都是镶嵌型的。将表达EGFP的卵裂球进行核移植后,4.5%的由核移植卵发育来的桑葚胚在所有的卵裂球中均有很强的EGFP信号的表达。而在其他胚胎中,EGFP信号几乎消失。当来源于EGFP阳性的核移植桑葚胚的细胞被2次培养时,所有的细胞在第2阶段均表达有很强的EGFP信号,并且显示了新霉素抗性。这些结果表明,屡次呈现非整合的EGFP的暂时性表达,并且在EGFP阳性卵裂球核移植后的EGFP阳性