聚d,l乳酸在大鼠体内的降解及神经诱导再生

聚d,l乳酸在大鼠体内的降解及神经诱导再生

0神经诱导修复材料的选择神经系统是人体最重要的器官。一旦神经受到损伤，器官的正常活动功能（运动功能和感觉功能）将受到影响。基于神经具有自再生的特点,以及用生物降解性材料进行神经诱导修复的优点,采用生物降解高分子进行神经诱导修复的组织工程已成为分子生物学界、医学界、材料学界等共同关注的研究课题。然而,虽然已有不少有关神经诱导修复的研究报道,但是由于至今在神经诱导管材料的降解性能、力学性能、生物相容性等方面还存在着各种各样的问题,因而至今还无法为受损神经提供既能起屏障作用、又能提供营养、具有神经再生所需三维空间结构的微环境,因此用生物降解高分子进行的神经诱导修复手术至今还未能在临床得到应用。聚乳酸(PLA)是一类重要的生物降解高分子。由于它的生物相容性好,在生理条件下可以自行降解,降解产物乳酸是人体本身所具有的物质;聚乳酸又具有良好的力学性能,其降解速度可以通过控制聚合物的分子量来调节,因此是最受人们注意、且应用最为广泛的生物降解高分子之一,且已在医学领域的手术缝合、骨修复和药物控释体系等方面得到了临床应用。基于聚乳酸的优良物理、化学和生物性能,本研究选择聚d,l-乳酸为神经诱导修复材料,用以制备神经导管对大鼠坐骨神经20mm缺损进行诱导修复。研究中采用肉眼观察、组织学检查、电镜观察、以及电生理测定等方法和手段,对神经诱导再生过程进行跟踪,揭示随着神经的再生聚d,l-乳酸管形态的变化,并对神经修复的效果进行评价和讨论。1实验部分1.1聚d,l-酸酯的合成按改进的文献方法,将减压脱水浓缩的dl-乳酸在ZnO催化下加热,收集沸程为110～130℃的粗d,l-丙交酯,用干燥甲苯进行2～4次重结晶后得到精制d,l-丙交酯。以十六醇为分子量调节剂(链终止剂),异辛酸亚锡为催化剂,将精制的d,l-丙交酯在真空条件下于130℃封管聚合6小时。聚合物的氯仿溶液经乙醇再沉淀纯化后,真空干燥,得纯化的聚d,l-乳酸。聚合物试片由模压法制备,模板温度为220℃、油压机压强为10MPa。1.2平均分子量的测定聚d,l-乳酸的分子量由粘度法测定。以氯仿为溶剂,在30±1℃下测定溶液的特性粘数[η]后,按式[η]=2.21×10-4M0.77计算平均分子量。1.3聚d和l-乳酸管的制备采用溶液和控制溶剂挥发的方法,将分子量为4.67×104的聚d,l-乳酸的10wt%二氯甲烷溶液于外径为2mm的聚四氟乙烯模具上成型。待溶剂挥发后再在室温减压条件下脱残余溶剂48小时。得到的内径为2mm、壁厚约为0.1～0.2mm的聚d,l-乳酸管,截成25mm长后于室温干燥器内保存。使用前,用福尔马林蒸汽熏蒸4小时消毒灭菌。1.4坐骨神经的分离和防护采用成年健康SD大鼠14只,均雄性,体重250～400g,用2%戊巴比妥钠按3mg/100g体重腹腔注射麻醉。鼠麻醉后以俯卧位固定于手术板上,用7%硫化钠溶液脱净手术部位毛发,再以1‰新洁尔灭酊将手术区消毒。在鼠股后外侧行纵行切口,直至暴露坐骨神经。仔细游离坐骨神经并造成坐骨神经20mm的缺损后,用聚d,l-乳酸管分别套入神经的远、近两端。套入深度为2.5mm,然后用11-0号单丝尼龙显微缝合线在距管边缘2.5mm处各缝一针与神经固定,最后进行肌肉和皮肤的缝合。1.5神经修复的观察和测试(1)生理检查及术后监测术后3、6、9周各处死2只大鼠,其余大鼠于12周做完电生理检查后处死。观察手术侧足趾皮肤的溃破、缺损及愈合情况,患肢的后蹬动作。观察原位缝合和无诱导修复手术部位的情况,以及桥接管的外形变化、吸收情况及对周围组织的反应。(2)半薄切片切片再生神经标本取下后置于2.5%的戊二醛中,于4℃固定24小时以上,然后用1%的OsO4固定1.5小时,逐级酒精脱水,用Epon812包埋后,以超薄切片机行半薄切片,切片厚0.5～1.0μm。用过饱和的氢氧化钠酒精溶液将切片上的环氧树脂洗脱后,再用100%乙醇洗涤二次,以1%的甲苯胺兰染色,行光镜观察。(3)轴突数目、轴突直径的图像分析按光镜方法固定大鼠再生神经中段及远侧神经段的半薄横截面切片,而后用日产LUZEX-F彩色实时图像分析系统进行轴突数目、轴突直径的图像分析。具体步骤是先测出每一切片的总面积和其中左上、左下、右上、右下、中央五个部分的神经纤维密度,求出切片内纤维总数,再随机在其中测量30～40条有髓神经纤维轴突直径。(4)双侧坐骨神经肌电图的制备术后12周,在室温下将实验动物麻醉后沿原切口入路,将坐骨神经从坐骨大孔起游离至胫腓神经入肌肉处,先后将刺激电极置于移植体近、远端的神经干上电刺激(强度30V,波宽0.2ms),在腓肠肌处插入记录电极接收,刺激电极为双根银丝的双根电极,记录电极为圆心针单极电极,用丹麦产E-VOMAPIC-800XT型诱发电位仪记录双侧坐骨神经肌电图及运动神经传导速度(MNCV),与正常侧的神经传导速度相比较以得到恢复率。(5)电子观察定期将鼠处死,取出再生神经标本,按前述光镜样品处理方法,行超薄切片(0.8μm),醋酸铀、枸橼酸铅染色后透射电镜观察。2结果和讨论2.1聚d和l-乳酸生长根据前文的研究结果,聚l-乳酸和聚d,l-乳酸均具有良好的生物相容性,然而由于聚l-乳酸为结晶性高分子,降解速度很慢;聚d,l-乳酸虽然为无定型高分子,生物降解速度较快,但分子量为37.5×104的聚d,l-乳酸在植入体内3个月后分子量仍有8万左右。为保证聚d,l-乳酸的降解和被机体吸收的速度尽可能地与神经的再生修复速度相匹配、使在神经得到再生修复后神经诱导管能及时地从体内消失,因而选用分子量较低(4.67×104)的聚d,l-乳酸为20mm神经诱导修复的材料。2.2m、管壁消毒灭菌采用溶液和控制溶剂挥发法,用分子量为4.67×104的聚d,l-乳酸制备成内径为2mm、壁厚约为0.1mm、管壁呈双层结构(内层为小孔、外层为大孔)(图1)的导管后,再截成25mm长并进行消毒灭菌。按图2模式,将经消毒灭菌的长为25mm的聚d,l-乳酸管分别套入神经的远、近两端,套入深度各为2.5mm,然后用0号手术线各缝一针以使管与神经的两端连接,以保证管内的神经远、近两断端间距为20mm和防止神经两断端从管中脱出。2.3术后神经电生理及观察采用肉眼观察、组织学检查、电镜观察和电生理测定等方法,对用聚d,l-乳酸管进行诱导修复的结果进行了观察,结果表明:术后3周:聚乳酸管外围有膜状物质覆盖,并且管的外形开始变化;术后6周:部分聚d,l-乳酸管被降解和吸收;术后9周:大部分聚d,l-乳酸管被降解和吸收,神经断口已经吻合;术后12周:聚d,l-乳酸管被完全吸收而消失。神经再生良好(图3),且可观察到已有微血管在其中生长。再生神经的剖面观察表明:吻合口处再生神经纤维平直(图4-a),且再生神经纤维密集、轴突直径较粗、髓鞘较厚(图4-b)。此外,术后12周的有髓神经纤维图象分析(表1)和运动神经传导速度测定结果(表2)表明:术后三个月,信息已经能够得到传输;与术前(图5-a)比较,神经传导已经部分得到恢复(图5)。由此可以结论为:断缺20mm的神经已由近端轴突顺利长入远端,神经的断缺已得到再生,神经的信息传输功能得到了初步恢复。3采用生物不可降解材料以上研究结果表明:用聚-d.l-乳酸诱导管对大鼠坐骨神经20mm断缺诱导修复取得了成功。聚d.l-乳酸神经导管具有良好的生物相容性,可用以进行长距离的神经断缺修复;聚d.l-乳酸在神经修复前可保持一定的强度、弹性和形状,具有双层孔结构的神经导管既可使体液进入导管,又能防止结缔组织的长入、从而可以保证神经再生通道的畅通;由于聚-d.l-乳酸可以在体内降解、被机体适时地吸收,从而可以避免采用生物