rp-hplc法测定热风藤茎叶果中番茄碱的含量

rp-hplc法测定热风藤茎叶果中番茄碱的含量

风藤是茄子科的一种独特植物，在中国广泛种植。在三峡地区，巴东、酉阳、扶桂、兴山和杏花分布在三峡地区的大部分地区。风藤也是人们非常广泛使用的流行中药。在本实验室中，对湖北恩施风藤的化学成分进行了分子动力学和药理学活性的研究。结果表明，它们中的氨基酸具有显著的抗炎性，而番碱是含量较大的成分。根据该实验室的报告，从风藤正丁醇部分的水不溶部分中分离出的番碱，采用ep-hplc精制，以威廉液相色谱法测定了全氮范碱的含量。本研究还对全氮范碱进行了测定，采用了高效液相色谱法测定了全氮范碱的含量。用甲醇超声辅助提取物测定，提取物浓缩，放入水中，用乙酸乙酯萃取，去除弱电阻滞，部分过滤水相，过滤后样品用甲醇溶解。利用高效液相色谱法测定了空气中的浮游生物含量，为更好地利用传统的中药风藤提供了科学依据。1材料和机器1.1对照品溶液的制备排风藤:于2010年10月采自中国湖北恩施,其原植物标本采自同一地区,经本实验室杨进副教授鉴定为Solanumcathayanu,原植物及药材现保存于本实验室(编号:SC201010ES).对照品:番茄碱,为本实验室自排风藤中分离得到,并经波谱学解析(NMR,ESI-MS)并结合文献确定其化学结构为番茄碱,以HPLC面积归一化法测定,纯度>98%.对照品溶液:准确称取番茄碱对照品适量,加甲醇配制成浓度约为1.0mg·mL-1的贮备液,临用时以甲醇稀释成0.10、0.15、0.25、0.40、0.50、0.60mg·mL-1的系列对照品溶液.1.2旋转蒸发仪器Prostar210型高效液相色谱仪(美国瓦里安Varian);N1001型旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司);ME215S型十万分之一电子天平(德国Sartorius);KQ-500DB数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司).2方法2.1色谱柱和检测条件对自排风藤正丁醇水不溶部分分离得到的粗番茄碱采用HPLC精制分离.色谱条件:YMC-PackODS-AA(250×10mm,5μm)色谱柱;柱温30℃;流速4mL·min-1;检测波长203nm;流动相为乙腈-水(90∶10,v·v-1).番茄碱色谱峰保留时间42.6min.将上述制备得到的流分减压浓缩,干燥得精制番茄碱,经面积归一化法测定纯度为98.2%.2.2番碱含量分析2.2.1柱温度和流动相YMC-PackODS-AA(150×4.6mm,5μm)色谱柱;流速1mL·min-1;柱温:30℃;流动相:乙腈-水(90∶10,v·v-1);检测波长:203nm;在此色谱条件下,对照品与供试品的保留时间一致(42.6min),供试品中番茄碱成分达到有效分离,分离度大于1.5.对照品及供试品的色谱图如图1所示.2.2.2供试品溶液的制备分别精密称取干燥的排风藤茎、叶、果粉末2g,加入25mL甲醇室温冷浸4h,于60℃下超声浸提60min,过滤,滤液减压浓缩至干,加入20mL水悬浮,用20mL乙酸乙酯萃取,分取水层,过滤,滤渣用10mL甲醇溶解,定容.以0.22μm微孔滤膜过滤,得供试品溶液,低温保藏备用.3结果与分析3.1碱对照品的hplc图谱分别精密吸取各番茄碱对照品溶液20μL进样,按2.2.1中色谱条件测定色谱峰面积(番茄碱对照品的HPLC图谱见图a),以峰面积Y为纵坐标,浓度X(mg·mL-1)为横坐标,绘制工作曲线,并进行线性回归.结果表明,在对照品浓度为0.10～0.60mg·mL-1范围内线性关系良好,回归方程:Y=5.0145×107X-0.2486,r=0.9997.3.2仪器精密度试验精密吸取0.10、0.25、0.60mg·mL-1的对照品溶液各20μL,按2.2.1中色谱条件连续进样,每个浓度进样3次,测定色谱峰面积,计算RSD为2.60%(n=9),表明仪器精密度良好.3.3叶部位平均峰面积测定取排风藤茎叶果各部位粉末约2.0g,每个部位6份,精密称定.按2.1方法平行制备,按2.2.1色谱条件下进行分析,测定茎部位的平均峰面积为7234412,RSD为2.60%;叶部位的平均峰面积为3237136,RSD为2.40%;果部位的平均峰面积为6749496,RSD为2.80%.3.4进样稳定性试验精密吸取排风藤茎部位供试品溶液20μL,于0、4、12、24、36、48h分别进样,测定其平均峰面积为7084945,其RSD值为1.67%(n=6),表明48h内供试品溶液稳定性良好.3.5加样回收率和rsd精密称取已知番茄碱含量的样品9份(排风藤茎部位样品),平均分为3组.各样品分别精密加入已知浓度的对照品溶液适量,按供试品溶液制备方法平行制备.按2.2.1中色谱条件,分别进样20μL进行测定,得平均回收率为97.6%(n=9),RSD为2.93%.结果见表1.3.6重新确定番茄碱的含量按2.2.1中色谱条件测定排风藤茎叶果中番茄碱的含量.排风藤茎叶果部位供试液的HPLC色谱图见图1.测得排风藤茎部位中番茄碱的含量为1.104mg·g-1,RSD为2.60%;排风藤叶部位中番茄碱的含量为0.494mg·g-1,RSD为2.40%;排风藤果部位中番茄碱的含量为1.030mg·g-1,RSD为2.80%;以茎部位中番茄碱含量最高.4室内模样测定和验证本文对采用系统分离方法得到的排风藤正丁醇部位中水不溶部分经正相硅胶柱层析后,重结晶纯化得到的粗番茄碱进行HPLC精制,采用超声辅助浸提的方法制备排风藤供试品,并且以精制得到的番茄碱为对照品,建立了RP-HPLC法测定排风藤茎叶果中番茄碱的含量.测得排风藤茎叶果中番茄碱的含量分别为1.104mg·g-1、0.494