稀土矿场条件下两耳草的土壤理化性质及细菌多样性

稀土矿场条件下两耳草的土壤理化性质及细菌多样性

中国稀土资源丰富，但开采方法简单。一般来说，采用硫酸铵、氯仿或碳酸铵盐酸铵盐酸钠提取稀土矿。使用这种“土法”提取稀土矿,废渣随意堆放地表,选矿废水肆意排放,废弃后经过长期风吹雨淋,矿区土壤结构破坏、肥力降低、有机质严重缺乏,植被难以生长,造成了严重的环境污染和生态系统破坏。针对稀土矿区资源的不合理利用和环境破坏状况的日益严重,2012年6月,我国国务院新闻办公室发布《中国稀土状况和政策》白皮书,以加大我国稀土资源和环境保护的力度,促进稀土行业持续健康发展。2014年3月,世贸组织裁定中国稀土限制案败诉一事加速了我国稀土矿开采和资源利用的紧迫感。从长远角度来看,稀土矿如何边开采边治理成为我国的稀土矿可持续发展的重要任务。因此,稀土矿区的生态修复急需一套合理的修复技术方案。本研究选用两耳草(PaspalumconjugatumBerg.)为试验材料进行稀土矿场中植物修复的土壤胁迫因子研究。试验将两耳草栽培在不同处理的稀土矿场土壤中生长,测定两耳草的理化性质(游离脯氨酸含量、叶绿素含量、可溶性糖和可溶性蛋白质含量)、酶活力(过氧化物酶POD活性、过氧化氢CAT酶活性、超氧化物歧化酶SOD活性)和土壤细菌SRAP多样性,分析植物生长的胁迫因子,为解决稀土矿场土壤中有机质缺乏、保水能力差、肥力缺失等问题提供解决方案,以便能更有效地对稀土矿区植物修复工程中改善植物生长发育并提高其抗逆性,制定出更为合理的植物修复方案。1材料和方法1.1试验材料供试植物两耳草采集于广东省和平县稀土矿区,采集后保存于仲恺农业工程学院钟村实验基地(广州市番禺区大石镇)。1.2测试方法1.2.1土壤元素含量采用露天盆栽的方式,将开采后的稀土矿场土壤装盆3kg,设水分组(前2周每天浇水,之后每2d1次)、大量元素组(浇1/10MS大量元素溶液,每3d1次,连续2次后浇去离子水)、有机质组(干草粉∶矿场土壤=1∶29)、菜园土组(菜园土∶矿场=1∶2)、鸡粪组(鸡粪∶矿场土壤=1∶29)和对照组(前2周每天浇水,之后停止浇水),每组5个重复,共30盆。把两耳草修剪成带有2~3个节的枝段,剪除多余叶片,每盆栽种5株(扦插苗),连续生长6周后采集植株叶片和盆栽表层1~5cm土壤。1.2.2脯氨酸、叶绿素及可溶性糖含量的测定两耳草叶片采集后,进行叶片的各项基本指标测定与比较。游离脯氨酸含量的测定采用磺基水杨酸法,叶绿素含量测定参考李海波等的方法,可溶性糖采用蒽酮比色法测定,可溶性蛋白测定采用考马斯亮蓝法测定。1.2.3sod活性的测定参照张志良等的《植物生理学实验指导》:POD活性采用愈创木酚法进行测定,于470nm波长处测量吸光度值;SOD活性采用氮蓝四唑(NBT)法进行测定,在560nm波长处测定各管的吸光度;CAT活性测定参照钼酸铵显色法,在240nm波长处测定吸光度。1.2.4ssr-pcr检测细菌的分离和DNA提取:各取土样0.5g,分别装入10mL离心管中,加入5mL重蒸水充分稀释,静置5min后取50μL于固体培养基上涂布均匀,28℃下培养24h。土壤含菌量(CFU/g)=(菌落平均数×稀释倍数)÷涂板吸取菌液量÷干土重量。再分别挑取单菌落于LB液体培养基中,于28℃恒温培养箱中震荡培养12~24h,提取细菌DNA,菌种DNA提取方法参考刘文等的总核酸提取方法。SRAP分子标记:SRAP的PCR扩增参照李春楠的方法,挑选F2R7、F2R3、F2R4、F5R7、F5R8共5对引物对各组样品进行PCR扩增,见表1。25μL反应体系包括10×Buffer2.5μL、MgCl21.5μL、dNTPs1μL、引物各0.5μL、Taq酶0.5μL,然后用ddH2O补至25μL。扩增程序为:94℃5min;94℃45s,35℃1min,72℃1.5min,共5个循环;94℃45s,50℃1min,72℃1.5min,共35个循环;72℃延伸10min,4℃保存。电泳图片记录有带赋值“1”,无带赋值“0”,构建0,1矩阵图,用POPGENE32软件计算多态位点比例P、等位基因数na、有效等位基因数ne、香农指数I、基因多样性指数h的遗传多样性参数。使用SPSS17.0软件进行各处理间微生物SRAP的主成分分析,将第一主成分和第二主成分构建二维矢量图。2结果与分析2.1稀土矿胁迫对植物叶片脯氨酸和鸡粪对可溶性糖的影响试验结果(图1)表明,不同因素处理的土壤对两耳草的脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白和叶绿素a、b的含量有一定的影响。在不同处理的稀土矿土壤盆栽中经过6周的生长,两耳草叶片内游离脯氨酸含量最少的是浇水组,为2.82μg/g,最多的是有机质组。有机质组和鸡粪组的脯氨酸含量比其余4个处理的高,差异显著。植物体内脯氨酸含量在一定程度上可以反映植物体的抗逆性,由此可以看出,在稀土矿场土壤中添加有机质或者鸡粪能够让两耳草的抗逆性更强,代谢过程更加稳定,让植物在稀土矿场土壤中更容易存活和生长。不同处理的两耳草叶片的可溶性糖含量在31.07~37.35μg/g之间,差异不显著,说明稀土矿耐受性胁迫对两耳草的可溶性糖含量影响不大。不同处理的两耳草叶片的可溶性蛋白含量在725.71~953.73μg/g之间。两耳草叶片中可溶性蛋白质含量最多的是对照组和大量元素组,明显高于其他4个处理,呈显著水平,含量最少的是有机质组和菜园土组。这说明两耳草在稀土矿土壤胁迫环境中可溶性蛋白含量上升,出现抗性应激反应。对照组、浇水组和大量元素组的叶绿素a含量高于其他3组;对照组、浇水组、大量元素和鸡粪组的叶绿素b含量明显高于有机质组和菜园土组,说明稀土矿土壤胁迫能够刺激两耳草叶绿素含量的上升。2.2不同处理的cat活性在不同处理中,两耳草叶片中的POD活性表现为3个水平,其中,POD活性最高的是浇水组,与其他处理组差异明显,最低的为菜园土组和鸡粪组。不同处理的CAT活性,大量元素组最小,低于其他5组。不同处理的SOD活性,对照和大量元素组的最高,鸡粪组的最低。研究表明,两耳草为适应稀土矿土壤的胁迫,提升了其体内的POD、CAT和SOD酶活力。同时研究结果还表明,稀土矿土壤中的水分、肥力和有机质是影响两耳草酶活力的主要因素。2.3不同土壤细菌试验结果显示,6个处理对稀土矿土壤的细菌数量影响明显,含菌量依次为2.45×104、1.78×104、1.90×105、2.49×106、2.00×106、9.96×106CFU/g。其中,水分组的土壤细菌数量最少,为1.78×104CFU/g,说明水分对限制植物修复土壤细菌的生长不明显。鸡粪组土壤细菌含量最高,达9.96×106CFU/g。从土壤细菌含量来看,在开采后的稀土土壤施加鸡粪、有机质和菜园土营养物质后,对土壤细菌数量增加有明显效果,表明土壤的质量越来越好,越来越适合土壤微生物的生存。选用扩增条带数较多、重复性好的5对SRAP引物对生态修复前后的稀土矿区土壤的细菌DNA样品进行PCR扩增,电泳结果(表2)表明,扩增片段大小在100~1500bp之间,多样性位点百分率基上达到99.83%,na基本上都达到2。不同处理中大量元素组的多样性位点最多,为25.4,而最少的是干草粉的多样性位点、只有12.4。从表3可以看出,菜园土组的多样性较高,其ne为1.3830,h为0.2494,I为0.4013。从构建的SRAP主成分分布(图3)看,不同处理组的细菌可分为2大亚群,6组的细菌大部分重叠在第一主成分0.1~0.8之间和第二主成分-0.6~0.7之间,说明各处理间的微生物类型总体差异不明显。另外,在第一主成分-0.2~0.1之间和第二主成分-0.1~0.65之间有5株细菌独立于主体之外,说明鸡粪处理的土壤细菌类型与其他处理的略有不同。3稀土矿场土壤对两耳草酶活力的影响为了改善和修复稀土矿场的生态环境,前人一般采用狼尾草、马唐草、地毯草、百喜草、宽叶雀稗等植物材料,用于对稀土矿场土壤的植被恢复进行分析研究。本研究以两耳草材料,用盆栽试验的方式分析稀土矿场土壤胁迫条件下的植物生长,发现两耳草对稀土矿场土壤具有较好的适应性,对于丰富矿场修复植物具有一定的意义。植物在受到环境胁迫时,一般其体内的脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白和叶绿素含量会发生明显的变化。本研究结果表明,两耳草在稀土矿土壤胁迫条件下,除可溶性糖变化不明显外,脯氨酸、可溶性蛋白和叶绿素含量的变化均明显,而且其含量在养分(有机质、肥力和水分)较为充足时表现为下降。这说明两耳草受稀土矿场土壤胁迫后,其脯氨酸、可溶性蛋白和叶绿素含量出现上升,以适应矿场土壤的逆境。POD、CAT、SOD的活力与植物体内各种酶的协同作用防御活性氧或其他过氧化氢自由基对细胞膜系统的伤害密切相关,测定它们的活性与植物的代谢强度、抗性有一定关系。本研究结果显示,在稀土矿场土壤中添加鸡粪、菜园土和有机质后,两耳草的POD、CAT、SOD活力基本呈降低趋势,说明稀土矿场土壤胁迫可以刺激两耳草酶活力的抗性反应。土壤细菌是反映土壤生态系统中物质和能量流动的一个重要指标,是土壤中物质转化和养分循环的驱动力,土壤类型特别是土壤的营养成分与土壤微生物的多样性有密切的关系。因此,土壤细菌成为土壤质量评价的重要指标之一。本研究发现稀土开采后土壤含菌量非常低,说明稀土矿的开采过程对土壤生态环境造成了严重破坏,导致可以在土壤中生产的细菌数量大量减少。稀土矿场土壤由于不同处理组外源细菌的引入,导致不同组细菌差异变化明显,其中