无酚棉籽粕的提取及预消化处理研究

无酚棉籽粕的提取及预消化处理研究

这些籽含有大量蛋白质，不仅是重要的植物饲料，也是世界上最重要的植物种类。棉籽粕中的蛋白质由良好的氨基酸组成,是氨基酸组成较齐全的优质高蛋白质饲料,蛋氨酸与胱氨酸含量高于大豆,并且与大豆一样具有很高的氨基酸利用率。棉籽中的棉酚及其衍生物对人和动物有毒害,主要是棉酚与某些酶及蛋白质结合,破坏了酶的活性及蛋白质的可消化性,阻碍了正常代谢。低酚棉籽中蛋白质含量和赖氨酸利用率比普通有酚棉籽高。我国是世界上最大的棉籽生产国,有巨大的植物蛋白质资源宝库,但榨油后约有80%棉籽粕被当作肥料直接下地,造成巨大的蛋白质资源浪费。因此,对棉籽蛋白质开发利用将是一项重要战略措施,通过对棉籽粕中蛋白质的研究,为大规模的工业生产提供了理论基础,棉籽蛋白作为高蛋白食品、高质量广谱饲料及医药工业原料等方面有很大的潜力与应用前景。1材料和方法1.1试剂、仪器和仪器棉籽粕(河北省机榨棉籽粕饼);中性蛋白酶;2709-PRE碱性蛋白酶(无锡市酶制剂厂);田氏指示剂;甲基红指示剂;甲基橙指示剂;1molHAcMAc缓冲液,pH约5.4;1%茚三硐-乙二醇甲醚色液(G/H);Folin试剂。日立-835-50型氨基酸自动分析仪;721分光光度计;LD4-2型医用离心机。1.2蛋白的提取和碱提称取10g棉籽粕,加入150mL蒸馏水后用30%氢氧化钠调pH至7.5,浸泡8h后过滤,滤液用浓盐酸调pH至4.2,大量沉淀析出,加入150mL无水乙醇,离心分离得到蛋白沉淀,无水乙醇洗涤2次,无水乙醚洗涤1次,干燥,称得蛋白的质量为1.18g。向水提后的残渣中加入0.1%氢氧化钠150mL,调pH至10~11,搅拌浸泡2h后过滤,滤液用浓盐酸调pH至4.2,其余步骤同水提,然后再重复碱提1次。第1次碱提蛋白为浅褐色,1.39g;第2次碱提后蛋白为褐色,0.3g。1.3氨基酸浓度测定1)100℃下短时处理:称取10g棉籽粕,加入1%醋酸20mL,在干燥箱中恒温100℃处理1h,然后提取蛋白,称得水提蛋白为0.38g,碱提蛋白为0.61g;以蒸馏水为空白对照,通过茚三酮显色法利用721分光光度计在λ=570nm处测定吸光度计算氨基酸质量浓度。2)常温下长时处理:向4份2.5g棉籽粕中各加入5mL蒸馏水,0.1%、0.5%和1%的醋酸溶液常温下处理24h后,加蒸馏水25mL,离心过滤得上清液,茚三酮显色法测定吸光度。1.4蛋白、碱提蛋白1)中性酶处理:称取10g棉籽粕,加入0.5%中性酶溶液20mL,调节pH至7,37℃恒温槽中水解4h,提取蛋白,称得水提蛋白1.13g,碱提蛋白1.46g。2)碱性酶(2709-PRE)处理无酚棉籽和有酚棉籽:称取有酚棉籽粕和无酚棉籽粕各2份,每份2g,各加入20mL蒸馏水,用10%氢氧化钠调节pH至9,然后均加入0.05g2709-PRE,搅拌后放入38℃恒温槽中温恒22h,离心,上清液过滤后取2mL滤液稀释至50mL容量瓶中,用Folin-酚试剂法测蛋白质质量浓度,采用纸上层析法分离并分析氨基酸。1.5氨基酸质量浓度测定1)预处理时间的选择:取10支离心管,各加入2g脱酚棉籽饼和20mL蒸馏水,用10%氢氧化钠调节pH至9,在其中5管中加入0.05g2709-PRE,然后将所有离心管放在38℃恒温槽中恒温,每4h为一时间间隔,最长为20h,采用Folin-酚法和茚三硐显色法测定氨基酸质量浓度。2)用水量的确定:称取5份2g的无酚棉籽饼,编号1、2、3、4和5,分别加入20、15、10、5和4mL蒸馏水,用10%氢氧化钠调pH至9,然后各加入0.05g2709-PRE,在38℃恒温槽中恒温20h,然后按顺序分别加入0、5、10、15和16mL蒸馏水,搅拌离心取上清液稀释200倍后测定OD值。2结果与讨论2.1棉籽粕蛋白的应用通过原氏提取法测棉籽粕的粗脂肪含量为8.2%,粗纤维含量为22%,蛋白质含量为43.8%,蛋白质提取率为65.6%,产率为28.7%。此棉籽粕饼为机榨饼,其中粗脂肪和粗纤维量十分接近,蛋白质的提取率及产率均较高,较普通机榨饼高近1倍,说明试验选用的棉籽粕质量较高,很适合于棉籽粕蛋白的开发利用。从表1可见:棉籽粕蛋白中的氨基酸含量均较高,尤其是氨基酸中的必需氨基酸远高于一般要求(35%)。因此,试验用棉籽饼粕蛋白是一种氨基酸齐全、比例合理且营养价值高的植物蛋白质。蛋白质中的氨基酸含量水提蛋白为57.27%,碱提蛋白为61.88%。2.21在延长时间的处理棉籽粕经醋酸处理后提取蛋白显著降低,由于棉籽蛋白在处理过程被HAc降解成水溶性的多肽和小肽,只剩下小部分蛋白。若延长时间,蛋白降解量将会增加,在足够长时间下可能完全水解为小肽甚至氨基酸。不经过醋酸处理的OD值为0.6,经过醋酸处理的OD值为0.68。从表2可见:经0.5%醋酸处理后,可溶性蛋白质及氨基酸质量浓度均升高,必需氨基酸含量(37.16%)也比未经醋酸处理的(35.89%)高,因此,低质量浓度醋酸高温短时间处理预消化效果明显。2.3醋酸质量浓度对棉籽饼最佳质量浓度的影响从图1可见:预消化饼的上清液中氨基酸质量浓度随醋酸质量浓度升高很快上升,并在0.5%醋酸质量浓度时达最大值,趋于平稳,所以,可选用醋酸质量浓度为0.5%作为常温下处理棉籽饼的最佳质量浓度。2.4碱性蛋白酶对棉籽饼上清液蛋白量的影响经过中性酶处理棉籽粕后,蛋白提取率下降,但下降不明显,这可能是棉籽粕中的棉酚对低质量浓度的中性酶有抑制作用,但仍有一部分蛋白被酶解。从表3可见:碱性蛋白酶对棉籽饼的处理十分有效,上清液中可溶性蛋白质量浓度是未经酶处理的4倍;去除或钝化棉籽饼的棉酚有利用于提高酶的预消化效果;提取时去除棉油和棉酚,使棉籽饼干燥易碎,尤其是可增加酶的活性,提高预消化效果;通过上清液的纸上层析分析可知,酶解处理后氨基酸数量和质量浓度均增加,效果十分显著。2.5酶消化对棉籽蛋白质量的影响从图2可见:在无酶条件下,由于棉籽饼中的低质量浓度碱的作用,棉籽粕上清液中的可溶性蛋白质量浓度呈直线下降,而氨基酸质量浓度却有上升趋势,这说明,碱处理不能增加上清液中的可溶性蛋白,只能将可溶性蛋白分解为小肽或氨基酸,且作用很不明显。从图3可见:在有酶条件下,酶消化饼的上清液中氨基酸质量浓度呈曲线上升,而且越来越快,上清液中的可溶液性蛋白质量浓度先呈缓慢上升趋势,到达最高点后呈下降趋势,下降速度较快。原因是酶的存在使棉籽蛋白降解,同时增加了上清液中的可溶性蛋白质量浓度和氨基酸质量浓度,其中可溶性蛋白也被酶降解为小肽和氨基酸。开始时由于生成可溶性蛋白质量浓度大于可溶性蛋白水解为氨基酸质量浓度,可溶性蛋白质量浓度呈上升趋势,到达最高点时二者速度达到平衡,随消化时间的增加,后者的速度越来越快大于前者的速度,使可溶性蛋白供不应求,呈下降趋势。因此,若从生成可溶性蛋白最多考虑,可选用12h作为最佳处理时间。2.6减少战争用量因为酶是具有生物活性的蛋白质,必须有充足的水分才能充分发挥其理化活性,为此在尽量发挥的酶活性前提下,减少用水量。从表5可见:随着用水量的增加,水解效果越明显,即可溶性蛋白质和上清液中氨基酸的质量浓度均升高,当用水量和棉籽饼量为5∶1时有一突跃,氨基酸和可溶性蛋白质量浓度突然升高幅度很大。因此,考虑到工业生产,选择棉籽粕5倍量的水作为最佳用水量。3棉籽饼的氨基酸含量和预消化时间的影响1)棉籽粕中蛋白质含量较高且提取率和产率均很理想,是氨基酸种类齐全及营养价值较高的植物蛋白质,蛋白质提取率随提取和沉淀时间的延长而增加。2)100℃下低质量浓度醋酸短时处理棉籽粕时,蛋白提取率很大,部分转化为可溶性蛋白、多肽、小肽甚至氨基酸;常温低质量浓度醋酸长时处理棉籽饼,上清液中氨基酸质量浓度随醋酸升