中药莲子心中3种酚性生物碱的含量测定

中药莲子心中3种酚性生物碱的含量测定

莲花是睡莲科植物的成熟种子。2010年版《中华人民共和国药典》记载其性苦、寒,归心、肾经,具有清心安神、交通心肾、涩精止血之功效,用于治疗热入心包、神昏谵语、心肾不交、失眠遗精及血热吐血等症。莲子心成分主要分为酚性和非酚性生物碱两大类,其中莲心碱(liensinine,Lien)、异莲心碱(isoliensinine,Iso)和甲基莲心碱(neferine,Nef)等酚性生物碱是目前公认的莲子心中主要有效成分,具有广泛的抗心律失常作用;近年来还发现莲子心酚性生物碱具有改善胰岛素抵抗、治疗糖尿病的作用。关于对莲子心中酚性生物碱的含量测定,特别是用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法同时对Lien、Iso和Nef进行定量分析的报道已有很多。荧光检测器(fluorescencedetector,FD)也是高效液相色谱仪常用的一种检测器。莲子心中酚性生物碱Lien、Iso和Nef具有双苄基异喹啉结构,属于多环芳烃类物质,在紫外灯下能产生强烈荧光,而对它们进行定量分析的HPLC-FD法国内外尚未见报道。本文建立了专属的反相离子对HPLC-FD法,对湖南、江西和福建等产地的莲子心中3种酚性生物碱进行测定,并与HPLC-UVD法的检测结果进行比较,现将实验方法和结果报道如下。1材料表面1.1仪器、试剂与仪器岛津高效液相色谱仪(日本Shimadzu制作所),包括LC-10AD泵、SPD-10A紫外检测器和RF-10A荧光检测器;AUTOSCIENCEAT-130柱温箱(天津奥特赛恩斯仪器有限公司);外置式(CT-21型)HW-2000色谱工作站(上海千谱软件有限公司);岛津RF-5301PC荧光分光光度计(日本Shimadzu制作所);METTLERAE-240电子天平(瑞士METTLERTOLEDO公司);KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司),最大功率:500W;SYZ-A石英亚沸高纯水蒸馏器(金坛市国胜仪器厂);高速中药粉碎机(武义县屹立工具有限公司);HH-6数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)。1.2uv、ir、1hnmr、13cnmr及ms的化学结构化学对照品莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱均从中药莲子心中提取、分离获得,经UV、IR、1HNMR、13CNMR、2DNMR和MS确定它们的化学结构,HPLC-UVD归一化法分析三者的纯度均达95%以上;乙腈为HPLC专用试剂,十二烷基磺酸钠、盐酸、冰醋酸和甲醇均为分析纯,水为重蒸馏水。1.3药用菌鉴定及药物鉴定3批莲子心药材分别来源于我国湖南、福建和江西省,经南京中医药大学药用菌与中药生物技术研究所潘扬研究员鉴定均为睡莲科植物莲NelumbonuciferaGaertn成熟种子的干燥幼叶及胚根。2方法和结果2.1对照品溶液的制备精密称定Lien4.78mg、Iso3.94mg和Nef4.83mg,置5mL量瓶中,加甲醇适量使溶解并稀释至刻度,作为各对照品储备液,4℃下冷藏。2.2荧光峰与em、em的扫描结果取用流动相稀释至一定程度的Lien、Iso和Nef对照品溶液,分别在荧光分光光度计上进行波长扫描。首先,设定2个激发波长(λEX),分别进行发射波长(λEM)模式下扫描,显示上述3种对照品溶液2次扫描所得λEM均在319nm左右相同位置处位移很少,因此认定其为荧光峰。然后,以319nm为发射波长,进行λEX模式下扫描,发现在233nm与280nm2处出现了吸收峰。但当λEX为233nm时,在319nm处甲醇溶剂的吸收也相当强;λEX为280nm时,甲醇溶剂几乎无吸收,最后确定荧光检测波长为:λEX=280nm,λEM=319nm(图1)。2.3减失剂的制备取莲子心(粉碎,过4号筛)0.5g,精密称定,精密加入2%盐酸甲醇溶液25mL,称定质量,加热回流30min,放冷,再称定质量,用2%盐酸甲醇溶液补足减失的质量,滤过。精密量取续滤液5mL,置10mL量瓶中,加流动相稀释到刻度,摇匀,0.45μm滤膜过滤,取续滤液进样。2.4流动相、荧光分离器色谱柱:Hedraue84aSymbolTC@ODS-2C18柱(5μm,4.6mm×250mm)江苏汉邦科技有限公司,批号:H1810405.25;流动相:乙腈-.015mol/L十二烷基磺酸钠(取十二烷基磺酸钠0.408g,加水100mL使溶解)-醋酸(55∶5∶1);流速:1.0mL/min;柱温:30℃。荧光检测器:激发波长280nm,发射波长319nm;紫外检测器:282nm,进样量:20μL。在此色谱条件下测定,理论塔板数按莲心碱计应不低于5000,各相邻色谱峰达到基线分离(见图2)。2.5流动相的稀释分别量取“2.1”项下各对照品储备液20、50、80、110、140、170、200、230μL,置于5mL量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀,进样20μL。分别以Lien、Iso和Nef的浓度(μg/mL)为横坐标(C),色谱峰的面积值(mV)为纵坐标(A),绘制标准曲线,结果见表1。2.6进样的测定和重现性测定精密吸取同一样品溶液,连续重复进样6次,进样量:20μL。记录Lien、Iso和Nef色谱峰的面积值(mV),并计算它们的RSD(%)。Lien、Iso和Nef的计算结果:RSD(%)分别为4.05、3.06和3.83,表明进样精密度良好。取莲子心(粉碎,过4号筛)0.5g,平行5份,精密称定,照“2.3”项下方法制备,精密吸取样品溶液20μL进样,测定样品中Lien、Iso和Nef的平均含量(%),并计算它们的RSD(%)。Lien、Iso和Nef的计算结果:平均含量(%)分别为0.095、0.114和0.392;RSD(%)分别为4.16、1.43和2.53,表明测定重现性良好。精密吸取同1样品溶液,在0h、4h、8h、14h、20h、32h、48h时各测定一次,进样量:20μL。记录48h内Lien、Iso和Nef的峰面积值(mV),分别计算它们的RSD(%)。Lien、Iso和Nef计算结果:RSD(%)分别为4.27、2.47和1.15,表明样品在48h内稳定性良好。2.7样品溶液的制备分别取已知含量的样品粉末0.4g、0.3g和0.2g,精密称定,平行2份,各精密加入3个不同水平(1∶2∶3)的Lien、Iso和Nef对照品溶液,照“2.3”项下方法制备样品溶液,注入高效液相色谱仪,进样量:20μL。测定并计算Lien、Iso和Nef加样回收率(%)及RSD(%),结果见表2。2.8紫外法检测样品中lien、iso和nf、uvd分别取莲子心样品,照“2.3”项下方法制备样品溶液,分别以荧光检测器(FD)和紫外检测器(UVD)进行测定,进样量:20μL,并用外标法计算样品中Lien(C37H42N2O6)、Iso(C37H42N2O6)和Nef(C38H44N2O6)的含量(%),结果见表3。3检测结果及方法学验证由于莲子心中3种酚性生物碱结构相似(近),其中莲心碱、异莲心碱互为同分异构体,三者荧光光谱的特性(激发光谱和荧光光谱)也基本类同,因此可采用统一的测定波长进行HPLC-FD法进行测定。本研究确定的激发光谱(280nm)和荧光光谱(319nm)完全符合斯托克斯发现的荧光定律,即发光物质因吸收电磁辐射(X射线、紫外光、可见光等)而发射荧光时,荧光的波长总是较所吸收辐射的波长为长(或相同)。实验结果还表明,相同浓度异莲心碱的荧光强度(峰高或峰面积)明显大于莲心碱和甲基莲心碱的荧光强度。通过对湖南、福建