短时受精在体外受精中的临床应用

短时受精在体外受精中的临床应用

随着体外受精（ivf）技术的日益改进，妊娠率显著提高。但仍有部分IVF周期会出现卵子完全受精失败,其发生率约10%～20%。这类患者往往由于精子主要参数显示正常,很难预测其发生。为避免IVF周期完全受精失败,越来越多的生殖中心采用短时IVF受精方案,以期尽早判断卵子受精状况,为及时行补救卵胞浆内单精子注射技术(ICSI)提供可能。大量实践表明,通过短时IVF受精联合早期补救ICSI可以很好地降低,甚至避免因IVF完全不受精而导致的周期失败,并可获得较好的临床结局。但有关短时精卵共孵育以及早期受精观察是否对可正常受精的IVF周期的受精率、胚胎发育潜能以及临床结局产生不良的影响仍存在着争议。有学者认为,短时IVF受精非但不能改善总周期妊娠率,反而会明显降低受精率。另有学者认为,短时受精可以使卵子减少过量精子及颗粒细胞代谢所产生的不良影响,从而提高胚胎种植率及临床妊娠率。本文对我中心不孕患者IVF周期短时受精与常规受精进行比较,现将结果总结如下,以期进一步探讨短时受精在体外受精-胚胎移植(IVF-ET)中的临床应用价值。1对象和方法1.1理想妊娠的符合条件回顾性分析2008年1月至2010年7月期间在我院生殖中心接受IVF-ET治疗的不孕患者资料,入选条件:均无IVF-ET治疗史;男方精液常规和形态学检查显示正常,不具备卫生部规定的ICSI指症要求;入选周期均采用常规长方案或短方案。对所有男方无明确生育史者,行短时IVF受精方式(Ⅰ组),而同期男方有生育史者,则采用常规IVF受精方式(Ⅱ组)。女方不孕因素包括输卵管因素、子宫内膜异位综合征、排卵障碍、不明原因经2次以上IUI未获妊娠者等。两组女方患者基础内分泌值均在正常范围,平均不孕年限、体质指数、周期Gn用药数量等均无显著差异。1.2方法1.2.1阴道取卵与阴道取卵采用常规长方案和短方案刺激,当至少有1个卵泡直径>18mm或2个卵泡直径>17mm或3个卵泡直径>16mm时停用Gn,给予肌肉注射HCG5000～10000U,注射后36～38h在B超引导下经阴道取卵。1.2.2精的取精精液采用WHO标准进行精液的常规分析和巴氏染色法进行严格的形态学检查。取卵当天上午男方用手淫法取精,收集全部精液于无菌无毒容器内。收集的精液置室温液化后采用密度梯度离心法进行洗涤,处理后用于加精的精子密度调整至≥5～10×106/mL,放入5%CO2,37℃培养箱内上游,至少培养30min后用于加精。1.2.3精子浓度的确定卵母细胞于取卵后放于5%CO2,37℃培养箱内培养2～4h授精,授精精子浓度2万条/每卵,Ⅰ组精卵共孵育5～6h后去除卵丘细胞;Ⅱ组精卵共孵育16～18h后再剥除卵丘细胞,观察卵子原核和极体数目,以确定卵母细胞受精状况。1.2.4优质胚胎的移植根据卵裂球数目、大小、形态、是否均匀及有无碎片和发育速率进行胚胎质量评估。将卵裂速度正常,第2天≥3个卵裂球,或第3天出现至少6细胞,卵裂球大小均匀或轻度大小不均,无核碎片≤20%的胚胎定义为优质胚胎。选择优质胚胎,35岁周岁以下患者移植2枚,35岁周岁以上者移植2～3枚,剩余优质胚胎予以冷冻。移植后14d进行尿和(或)血清hCG检测,阳性者为生化妊娠,于移植后35d超声观察妊娠囊及原始心血管波动,确定临床妊娠。1.3统计学处理数据以均数±标准差或率(%)表示,采用SPSS16.0数据分析软件包进行统计学处理。两样本均数比较采用两样本t检验,两组率比较采用四格表χ2检验;P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1相互匹配的患者ssg同时期共240例行短时受精,其中发现23例完全受精失败周期,对该类患者及时行补救ICSI,获得了11例临床妊娠。本文未将完全受精失败周期统计入短时受精组,实际采用217例短时受精周期数据为Ⅰ组;而同期共有413个周期常规IVF受精方式,均未见完全受精失败现象,全部数据均被采用(Ⅱ组)。2.2卵裂率与受精率Ⅰ组217个周期共获卵3007枚,Ⅱ组413个周期共获卵5586枚,两者的受精率、正常受精率、多精受精率、卵裂率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。而Ⅰ组的优质胚胎率显著高于Ⅱ组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。2.3两组冷冻周期率的比较Ⅰ组与Ⅱ组的临床妊娠率、胚胎种植率比较,差异无统计学意义(P>0.05),Ⅰ组的冷冻周期占移植周期的78.34%,高于Ⅱ组的冷冻周期率为72.88%,差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。3抗混血药实验研究自1978年人类IVF-ET获得成功以来,其周期临床妊娠率已得到了很大的提高。其中一个主要因素是卵子/胚胎质量的提高。常规采用的IVF受精方式,即包裹大量颗粒细胞的卵丘卵母细胞复合物(COC)与大量精子(2～10万/卵子)在体外共同培养过夜(16～18h),以充分保证精卵有足够的受精时间,以期获得较高的受精率。然而,一些研究表明,常规IVF受精方式由于精卵长时间的共孵育,大量细胞代谢和凋亡过程会产生大量的代谢产物以及过氧化物,如ROS以及其他有害因子,消耗培养基营养,使透明带硬化,损伤胚胎的DNA,并可能影响精卵正常受精和胚胎发育潜能。另有研究表明,人类精子在15min内即可进入卵丘细胞团,并完成受精过程。因此,一些学者认为,采用短时IVF受精在理论上避免了常规IVF受精中的一些缺点,如可以减少营养消耗、减少ROS的产生和损伤等,从而可能有利于胚胎发育。短时受精结合补救ICSI可以有效减少由于IVF完全不受精造成的周期失败,已被大多数胚胎学家所认可。但对于短时受精是否可能影响可正常受精周期的受精率及胚胎的发育潜能及临床妊娠结局,仍存在着争论。Kattera等通过短时受精提高胚胎的质量,显著的增加了胚胎植入率和临床妊娠率,并得到了其他学者的认同。另有一些学者认为缩短精卵共孵育时间不能改善胚胎质量和临床妊娠率。而Barraud-Lange等通过一项前瞻性对照研究,采用精卵1h与18h的孵育时间比较,结果表明缩短精卵孵育时间不但不能提高胚胎质量,而且还降低了受精率,从而可能影响临床结局。本研究结果显示,短时受精组受精率与常规受精组的相似(77.79%vs77.68%)。然而,短时受精组的优质胚胎率却明显高于常规受精组(64.39%vs59.69%,P<0.05)。这一结果与Kattera等研究相一致。短时受精组精卵孵育的时间短,减少了一些可能的不利胚胎发育的因素,可能是使短时受精组有较高的优质胚胎率的原因之一。优质胚胎数目的增加,可以增加周期冷冻率和冷冻胚胎数目,从而可能提高周期累积妊娠率。多原核受精是一种异常受精现象,在IVF中多原核受精的胚胎通常为多倍体,不能用于移植,导致了较多胚胎的废弃,造成了卵子资源的浪费。引起多原核发受精的因素较多,主要与女方卵子的成熟度及男方的精液质量相关。有研究显示,短时受精可以降低多核受精的比例。本研究通过比较两组的多原核受精率,短时受精组多原核受精率略高于常规受精组,无统计差异,表明短时受精并不能有效降低多原核受精