氧化还原态失衡与动脉粥样硬化的关系

氧化还原态失衡与动脉粥样硬化的关系

氧气损伤与动脉硬化的发展关系得到了广泛认可，但还原性维生素对动脉硬化的预防效果并不理想。其中部分原因可能与动脉粥样硬化患者的氧化还原态(redoxstatus)不同有关。正常人有一个相对稳定的氧化还原平衡态。偏离该平衡态,无论向氧化方向偏移或向还原方向偏移都可能导致疾病的发生发展。动脉粥样硬化患者的氧化还原态如何改变尚少见报道,为此,本研究对167例心血管病患者血浆氧化还原态进行监测,并同期进行颈部血管超声检查,探讨血浆氧化还原态变化与其颈动脉内膜增厚及粥样斑块形成的关系,以期为动脉粥样硬化的认识及防治提供新的思路。数据和方法一、患者性别、年龄及分组所有患者为2004年2月至2005年9月在河南省人民医院心内科的住院患者,共167例,男96例,女71例,年龄41~86(74.6±17.9)岁。排除严重肝、肾疾病、内分泌代谢疾病、结缔组织疾病和肿瘤。患者行颈部血管超声检查,按内膜中层厚度或斑块形成分为三组:斑块形成组(A组)79例;内膜中层增厚组(B组)52例;内膜中层正常组(C组)36例。二、学习方法1.颈动脉内动脉检查采用SONO5500型彩色超声血流仪,行两侧颈动脉检查,固定专人测定,探头频率为7.5MHz。患者仰卧位,先从锁骨的内侧端横向扫查颈总动脉,然后将探头沿其行走方向向头侧移位,跨过分叉部,分别检测患者双侧颈总动脉、颈动脉分叉部、颈内动脉起始处、颈外动脉。检查内容包括:颈动脉内膜中层厚度(IMT)及有无斑块形成。内膜中层厚度<1.0mm定义为内膜中层厚度正常,内膜中层厚度1.0mm~1.3mm为内膜中层增厚,以内膜局限性突出管腔、内膜厚度≥1.3mm为斑块形成指标。以任何一处最大IMT作为判定标准。2.还原型还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的制备取研究对象清晨空腹静脉血3ml,放入预冷肝素抗凝管中,试管放在冰水混合物中保存,1h内低温(4℃)5000r/min,离心3min,取500μl血浆超低温(-30℃)保存在EP管中,备测还原型辅酶Ⅱ(NADPH)和氧化型辅酶Ⅱ(NADP+)。另取750μl血浆加入10%偏磷酸750μl,低温(4℃)5000r/min,离心15min,取上清液500μl,超低温(-30℃)保存在EP管中,备测还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)。其余血浆用以测定氧化应激产物:氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)和丙二醛(MDA)。3.mda和mda的测定ox-LDL用ELISA法测定(试剂盒由上海荣盛生物有限公司提供),MDA用硫代巴比妥法检测(试剂盒由南京建成生物工程研究所提供),所有测定步骤均按说明书严格操作。4.gsh的衍生化(1)测定的基本过程:利用荧光分光光度计对GSH及GSSG标准品进行全波长扫描,确定激发波=334.4nm,发射波=424nm以及5nm的谱带宽度,以pH8.3的磷酸盐缓冲液作为缓冲液,用100μl10mmol/L邻苯二甲醛甲醇溶液对GSH进行衍生化30min后测荧光值。以标准品浓度为自变量,荧光值为应变量,求直线方程,YGSH=6.9+8.6X,YGSSG=6.2+17.2X,并制作标准曲线。据此测定三组研究对象血浆GSH及GSSG。(2)GSH/GSSG氧化还原电位的计算:按Nernst方程:Eh=E0+RT/2Fln[(GSSG)/(GSH)2]。其中,R为气体常数,T为温度,F为法拉第常数。E0为GSH-GSSG的标准电位值,以血液pH值=7.4时,标准E0为-264mV。根据此公式计算GSH-GSSG的氧化还原电位值。5.nadph的测定(1)测定的基本原理:经酸或碱处理后,血浆中只剩下一种形式的辅酶Ⅱ(NADPH被酸破坏,NADP+被碱破坏)进入循环反应,NADPH可在N-甲基吩嗪甲基硫酸盐中介下,使噻唑蓝还原为甲肷,同时生成的NADP+再次经6-磷酸葡萄糖和6-磷酸葡萄糖脱氢酶作用生成NADPH(NADP+的循环测定从此步反应开始),再使噻唑蓝还原为甲肷,后者生成率与辅酶Ⅱ的含量成比例。因为甲肷在570nm处有最高吸收峰,因此可用分光光度法测定某一时间点的吸光光度值,根据辅酶Ⅱ的标准曲线来定量血浆中NADPH含量和NADP+含量。(2)NADP+和NADPH氧化还原电位的计算:按Nernst方程:Eh=Eo+RT/2Fln[(NADP+)/(NADPH)]。其中,R为气体常数,T为温度,F为法拉第常数。E0为NADP+/NADPH的标准电位值,以血液pH值=7.4时,标准E0为-342mV。根据此公式计算NADP+/NADPH的氧化还原电位值。三、统计分析方法全部数据采用SPSS11.5统计分析软件包进行统计分析,计量资料以均数±标准差表示,组间比较采用方差分析,两个指标的相关性采用相关分析,以P<0.05为差异有统计学意义。结果一、gsh/gssg氧化还原电位随动脉内膜增厚、斑块形成,血浆GSH含量逐渐减少,血浆GSSG含量逐渐增多,GSH/GSSG比值降低,GSH/GSSG氧化还原电位升高向氧化方向偏移(表1)。二、血浆中的酶氧化还原随动脉内膜增厚、斑块形成,NADPH/NADP+的氧化还原态显示出与谷胱甘肽相似的变化,但不如谷胱甘肽氧化还原态的变化明显(表2)。三、群体中的革兰氏反应产物水平氧化应激产物ox-LDL和MDA,斑块形成组高于内膜中层增厚组,内膜中层增厚组高于内膜中层正常组,比较详见表3。四、谷胱甘肽氧化还原电位上述结果显示,将患者按颈动脉内膜厚度分组时,随内膜增厚、斑块形成,各氧化还原态指标都产生相应的氧化偏移。由于谷胱甘肽氧化还原电位是显示血浆氧化还原电位的较直观指标,该电位越高(负值越小),表示氧化能力越强。为此,我们将谷胱甘肽氧化还原电位变化与氧化应激的损伤产物ox-LDL行相关分析,发现它们之间具有紧密的内在联系。NADPH/NADP+的氧化还原电位与氧化应激损伤产物ox-LDL的关系不如谷胱甘肽明显,故未纳入相关分析。1.由于葡萄糖氧化还原态位移的关系，ox-ldl产生的络合物含量谷胱甘肽氧化还原电位向氧化方向偏移度与ox-LDL生成量呈显著直线正相关,γ=0.817,P<0.01(图1)。2.氧化还原电位从动脉内膜正常到动脉内膜增厚,GSH/GSSG氧化还原电位逐渐升高,向氧化方向偏移;从动脉内膜增厚到动脉内膜粥样斑块形成,GSH/GSSG氧化还原电位进一步升高(图2)。gsh/gssg氧化还原态的偏离子研究本研究显示,将患者按超声心动图监测的颈动脉内膜厚度分组时,随内膜增厚(提示动脉粥样硬化的发展),其氧化还原态指标、特别是还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)氧化还原电位逐渐升高,显示出进行性的氧化偏移,其氧化还原平衡态向氧化方向偏移度与ox-LDL的生成呈显著正相关。GSH/GSSG被认为是细胞内主要的氧化还原缓冲对,GSH可清除活性氧,维持生物大分子的巯基活性中心,细胞内的谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽转硫酶等重要的抗氧化损伤、解毒酶类都需要GSH提供活性巯基。另一方面,蛋白质分子中大量的二硫键结构亦与蛋白质的功能密不可分,这亦需要一定的GSH/GSSG氧化态维系。因此,机体内必有一个相当恒定的GSH/GSSG氧化-还原平衡态。GSH/GSSG向氧化方向偏移时可产生类似过氧化氢增多时产生的氧化损伤效应。ox-LDL和丙二醛是氧化应激损伤的产物,特别是ox-LDL,被认为与动脉粥样硬化的发病有密切的关系。因此,本研究选择上述指标以观察氧化还原态偏移及其对氧化应激损伤的影响。还原性维生素(VitC,VitE)治疗动脉粥样硬化的氧化应激损伤,是一条合理思路,已被部分医务人员用于临床。但一些大样本、多中心的研究结果显示,还原性维生素对动脉粥样硬化的预防、治疗效果并不理想。我们认为,由于个体内在的氧化还原态偏移方向和程度的差异,均使用“规定”剂量的还原性维生素,并不适于矫正所有患者的氧化还原态偏移。而且,由于机体基础氧化还原态的差异,还原性维生素并不总能提供抗氧化保护。氧化-还原反应是根据反应体系中氧化还原电势来决定电子流向的,如维生素C是一个典型的抗氧化剂,但一定条件下却可以生成抗坏血酸自由基,成为一个氧化增强剂。还原性维生素不一定能矫正细胞内最重要的GSH/GSSG氧化还原对的偏移。因此,了解不同患者体内氧化还原态的偏移方向和程度,应是制定抗氧化应激方案的基础。而本研究的结果显示:动脉粥样硬化患者的GSH/GSS