脑肿瘤中组织型谷氨酰胺氧化酶表达的研究

脑肿瘤中组织型谷氨酰胺氧化酶表达的研究

广泛分布于组织中的氨基丙烯酸酶（ttg）。这是一种多功能酶。它不仅可以激活各种蛋白质，形成联合分子，还可以稳定细胞外基质，调节肿瘤生长、细胞分化、细胞死亡和细胞聚集。我们研究采用SP免疫组织化学方法,检测140例脑肿瘤中tTG蛋白表达,结合临床资料分析其与肿瘤组织来源和病理分级的差异性,探讨脑肿瘤中tTG蛋白在肿瘤类型和肿瘤恶性程度中所发挥的作用。材料和方法1.脑肿瘤he染色及病理检查依据62例星形细胞瘤、18例少突胶质细胞瘤、30例良性脑膜瘤、30例垂体腺瘤标本取自1996年1月～2000年1月我院病理科存档标本。10例正常脑组织,由内减压术中取得。全部脑肿瘤标本均进行HE染色,常规病理检查,并按照1993年WHO脑肿瘤分类标准进行分级。其中,内皮型脑膜瘤12例,成纤维型脑膜瘤9例,沙粒型脑膜瘤2例,混合型脑膜瘤7例。泌乳素细胞腺瘤(PRL腺瘤)15例;生长激素细胞腺瘤(GH腺瘤)15例。星形细胞瘤:Ⅰ级14例;Ⅱ级8例;Ⅲ级12例;Ⅳ级28例。少突胶质细胞瘤:Ⅱ级10例;Ⅲ级8例。男性97例,女性53例,年龄8～75岁,平均(42.2±14.3)岁。2.抗水平免疫组织化学(1)鼠抗人tTG单克隆抗体(克隆号:CUB7402):浓缩型,购自美国Maxim公司(稀释度1∶50);(2)链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶(SP法)免疫组织化学染色超敏试剂盒:购自美国Maxim公司;(3)胰蛋白酶试剂盒:购自福州迈新公司;(4)DAB显色试剂盒:购自美国Maxim公司。3.免疫组织化学染色石蜡标本做连续4μm厚度切片,HE染色。采用免疫组织化学染色SP方法检测CD34和tTG,操作按说明书进行。用PBS替代第一抗体作阴性对照。4.染色强度及细胞系数的计算与两位病理科医师一起观察每张切片10个具有代表性的高倍视野,tTG蛋白阳性判断标准:阳性染色者在细胞质有棕黄色颗粒沉着。根据肿瘤细胞质的染色程度以及染色细胞百分率计算免疫反应评分(immunoreactivescore,IRS)。按照Macpherson等评分公式:IRS=(Pi×i)/4,i为染色强度;Pi为标本的阳性细胞百分率。在观察标本10个有代表性的视野后,分析染色强度,并在高倍镜下计数1000个细胞的阳性细胞数,计算阳性细胞百分率,着色细胞占计数细胞百分率0～9%为0分,10%～39%为1分,40%～69%为2分,70%～89%为3分,90%～100%为4分;染色强度(i)可分为基本不着色者为0分,着色淡者为1分,着色适中者为2分,明显着色者为3分,强着色者为4分;分别对每个标本计算IRS得分。5.统计评估采用SPSS10.0统计软件包进行统计,选用One-WayANOVA检验进行统计学处理。血管内皮细胞外基质中ttg蛋白表达多种脑肿瘤tTG蛋白表达特点:脑肿瘤组织中tTG表达呈异质性,主要定位于血管内皮细胞、部分血管基底膜和部分肿瘤细胞胞质;细胞外基质中有时可见少量表达,但正常脑组织中仅有血管内皮细胞有tTG蛋白表达(表1)。此外,值得注意的是在胶质母细胞瘤坏死区周围的肿瘤细胞tTG蛋白呈强阳性表达。1.不同类型血管内皮细胞dtg蛋白表达水平比较全部脑肿瘤和正常脑组织的小动/静脉和微血管内皮细胞均有tTG蛋白阳性表达(图1～5),部分血管基底膜可见表达。不同类型脑肿瘤血管内皮细胞tTG蛋白表达的强度差异有极显著性意义(P=0.000);其中,不同类型的良性脑膜瘤、垂体腺瘤与正常脑组织之间tTG蛋白表达差异无显著性(P=0.14),而良性脑膜瘤和垂体腺瘤与星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤之间差异有极显著性意义(P=0.000);高分级星形细胞瘤(Ⅲ～Ⅳ级)血管内皮细胞呈强阳性表达,与低分级(Ⅰ～Ⅱ级)之间比较差异有极显著性意义(P=0.000,表2)。在正常脑组织的细胞外基质中,tTG蛋白表达阴性;在部分脑肿瘤中,血管周围的细胞外基质有tTG蛋白表达,并伴之有部分血管基底膜破裂。2.不同类型脑肿瘤肿瘤细胞ttg蛋白表达变化光镜下观察可见tTG表达于星形细胞瘤、少突细胞胶质瘤、脑膜瘤和垂体腺瘤部分瘤细胞胞质,尤其在胶质母细胞瘤坏死区周围的肿瘤细胞呈强阳性表达(图5)。不同类型脑肿瘤肿瘤细胞tTG蛋白表达差异有显著性意义(P=0.037);其中,良性脑膜瘤和垂体腺瘤与星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤之间差异有显著性意义(P=0.021),但与正常脑组织之间差异无显著性意义(P=0.154);在相同病理分级的星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤之间比较差异无显著性意义(P=0.12),而不同病理分级胶质瘤之间比较差异有极显著性意义(P=0.002,表2)。3.不同脑肿瘤中ttg蛋白表达变化由表2可见,肿瘤细胞内tTG蛋白表达与患者的性别、年龄差异无显著性意义(P>0.05)。10例正常脑组织中胶质细胞tTG蛋白表达均为阴性,而在多种脑肿瘤中,部分肿瘤细胞中可见tTG蛋白呈阳性表达;随着胶质瘤(星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤)恶性程度的增加,tTG蛋白在肿瘤细胞中的表达强度明显增高(P<0.001);与低分级(Ⅰ～Ⅱ级)相比,高分级星形细胞瘤(Ⅲ～Ⅳ级)tTG蛋白表达显著增强。正常脑组织与胶质瘤相比,tTG蛋白表达差异有极显著性意义(P<0.0001)。此外,有1病例病理诊断为星形细胞瘤左额叶Ⅲ级及左颞叶Ⅳ级,其Ⅳ级瘤细胞tTG蛋白表达明显强于Ⅲ级瘤细胞。4.低倍镜下效果在胶质母细胞瘤中,发现在坏死和凋亡组织周围的肿瘤细胞tTG蛋白表达呈强阳性。在肿瘤坏死区边缘形成一条‘隔离带’,在低倍镜下,可以直接区分坏死组织和非坏死组织(图5),称之为“假栏栅细胞”。坏死组织周围的“假栏栅细胞”中tTG蛋白表达最为强烈,而坏死组织内基本没有tTG蛋白表达。在光镜下观察,可以看到凋亡小体呈tTG蛋白阳性染色,但是tTG蛋白阳性肿瘤细胞自身没有表现出明显的凋亡形态学特征。连蛋白的表达谷氨酰胺转氨酶(TG)是钙依赖性激酶家族成员之一,目前发现有5种亚型,其中tTG蛋白分布最为广泛,在血管内皮细胞、平滑肌细胞等多种组织细胞中有表达。tTG蛋白是一种多功能酶,可以催化多种蛋白质形成交联分子。研究发现,在细胞内tTG蛋白介导形成的蛋白交联大分子可以成为多种病理状态的标记物,例如,老年性痴呆症组织中的老年斑和帕金森病组织中的Lewy小体均由tTG蛋白催化形成。目前已发现肝细胞瘤、横纹肌肉瘤和乳腺癌tTG蛋白表达量与酶活性均有不同程度的增加。而且在神经系统中,tTG蛋白与神经元发育、轴突生长和神经递质释放有密切关系。我们发现多种脑肿瘤的血管内皮细胞和瘤细胞内的tTG蛋白表达与患者的性别、年龄差异无显著性意义。其中,正常脑组织和多种脑肿瘤的血管内皮细胞tTG蛋白呈阳性表达,支持Haroon等认为血管内皮细胞可以合成和分泌tTG蛋白的研究结果。Chen等发现,在血管内皮细胞中tTG表达的增加可以促进细胞黏附和运动,增加纤维黏连蛋白的聚合作用。胶质母细胞瘤血管内皮细胞中tTG蛋白表达增加,低分级星形细胞瘤中血管内皮细胞表达弱或不表达,提示tTG表达有助于血管形成和生长。此结果与Hilton等的研究结果基本一致。胶质母细胞瘤血管内皮细胞过度表达的tTG可能通过纤维蛋白原交联反应发挥一定作用,并通过促进血栓形成参与胶质母细胞瘤发生多发性坏死的过程。在本研究中还发现部分Ⅳ级星形细胞瘤血管周围的细胞外基质有tTG蛋白表达,伴随部分血管基底膜发生破裂,提示细胞外基质中的tTG蛋白可能是血管内皮细胞合成后分泌或破裂释放的。此外,随着胶质瘤(星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤)分化程度的降低,tTG蛋白在肿瘤细胞上的表达强度明显增加,且高分级胶质瘤(Ⅲ～Ⅳ级)tTG蛋白表达阳性率显著高于低分级(Ⅰ～Ⅱ级),这与Iwaki等提出的在胶质瘤中tTG蛋白表达可以促进肿瘤恶性演变的观点相一致。Tunici等在鼠脑胶质瘤的研究中发现,随着肿瘤细胞的增殖,tTG蛋白表达量进行性增多;tTG蛋白活性在胶质瘤中发生重新分布,晶体样tTG较正常脑组织减少50%,与之相反的是具有催化蛋白质交联活性的颗粒样tTG增加了380%。另有研究表明,作为具有GTP酶活性的GTP结合蛋白,tTG可以激活蛋白激酶C,进而调节肿瘤细胞周期的进展,促进肿瘤增殖和恶性进展。在本研究中,有1病例为巨大左额颞叶胶质瘤,病理诊断为星形细胞瘤左额叶Ⅲ级,左颞叶Ⅳ级,其颞叶Ⅳ级瘤细胞tTG蛋白表达明显强于额叶Ⅲ级瘤细胞,表明同1病例的不同亚细胞群肿瘤细胞tTG蛋白表达也存在差异性,推测tTG蛋白可能促进星形细胞瘤的恶性进展。经体外研究发现,tTG活性增加有助于肿瘤细胞与纤连蛋白稳定结合;进一步研究又发现,纤连蛋白可以与tTG结合,对抗基质金属蛋白酶对tTG的分解作用,保护细胞,促进细胞黏附和运动。在胶质母细胞瘤中,发现在坏死和凋亡组织周围的肿瘤细胞tTG蛋白表达呈强阳性,假栏栅细胞中表达最为强烈,坏死组织内基本没有tTG蛋白表达的实验结果,证实了Hilton等和Iwaki等研究结果,表明高度恶性肿瘤细胞可通过表达tTG蛋白进行自我保护,使肿瘤内的细胞坏死和凋亡局限化,从而对抗机体细胞免疫和体液免疫反应对肿瘤细胞的杀伤效应。并且,tTG蛋白表达有可能具有稳定细胞,保持细胞完整性,阻止或延缓细胞释放溶酶体酶等细胞毒性物质的功能,避免继发性机体炎症反应。总之,tTG蛋白属于一种保护肿瘤细胞的蛋白,可以‘组装’和‘重建’肿瘤细胞外基质、对抗凋亡和坏死细胞对其他肿瘤细胞的破坏。tT