色谱分析导论课件

色谱分析根底第一节色谱法概述一、色谱法的特点、分类和作用characteristic,classificationactuationofchromatograph二、气相色谱别离过程separationprocessofgaschromatograph三、色谱流出曲线与根本术语Chromatogramandnamewords

fundamentalofchromatographanalysis

generalizationofchromatographanalysis

2023/11/6一、色谱法的特点、分类和作用

1.概述混合物最有效的别离、分析方法。俄国植物学家茨维特〔Tswett)在1906年使用的装置：色谱原型装置，如图。色谱法是一种别离技术。试样混合物的别离过程也就是试样中各组分在称之为色谱别离柱中的两相间不断进行着的分配过程。其中的一相固定不动，称为固定相；另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体〔气体或液体〕，称为流动相。2023/11/6图示固定相——CaCO3颗粒流动相——石油醚

色带2023/11/6色谱法原理

当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复屡次的分配平衡，使得各组分被固定相保存的时间不同，从而按一定次序从色谱柱中流出。与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的别离与检测。两相及两相的相对运动构成了色谱法的根底2023/11/62.色谱法分类

按两相的状态不同主要分为两类：(1)气相色谱：流动相为气体〔称为载气〕。GSC和GLC2023/11/6(2)液相色谱：流动相为液体〔也称为淋洗液〕。按固定相的不同分为：LSC和LLC。

安捷伦1100岛津Ic-2021ht2023/11/6按操作形式分类：〔1〕柱色谱填充柱色谱毛细管柱色谱〔2〕纸色谱〔3〕薄层色谱高效毛细管电泳色谱仪2023/11/6按别离原理分类：〔1〕吸附色谱

〔2〕分配色谱〔3〕离子色谱〔4〕凝胶色谱高效毛细管电泳色谱仪2023/11/63.色谱法的特点〔1〕别离效率高复杂混合物，有机同系物、异构体。手性异构体。〔2〕灵敏度高可以检测出μg.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。〔3〕分析速度快一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。〔4〕应用范围广气相色谱：沸点低于500℃，操作条件下热稳定物质。液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的别离分析。缺乏之处：被别离组分的定性较为困难。2023/11/6二、色谱别离过程色谱别离过程是在色谱柱内完成的。以气相色谱为例。气固(液固)色谱和气液(液液)色谱，两者的别离机理不同。气固(液固)色谱的固定相:多孔性的固体吸附剂颗粒。固体吸附剂对试样中各组分的吸附能力的不同。气液(液液)色谱的固定相:由担体和固定液所组成。固定液对试样中各组分的溶解能力的不同。气固色谱的别离机理:吸附与脱附的不断重复过程；气液色谱的别离机理：溶解与挥发的反复屡次分配过程。2023/11/6气相色谱别离过程当试样由载气携带进入色谱柱与固定相接触时，被固定相溶解或吸附;随着载气的不断通入，被溶解或吸附的组分又从固定相中挥发或脱附;挥发或脱附下的组分随着载气向前移动时又再次被固定相溶解或吸附;随着载气的流动，溶解、挥发，或吸附、脱附的过程反复地进行；较难被吸附〔溶解〕的组分随载气较快地向前移动，较易被吸附〔溶解〕的组分那么随载气较慢地移动。经过一定时间后，各组分就彼此别离。2023/11/6三、色谱流出曲线与术语1.基线

无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线。2.色谱峰当某组分从色谱柱流出时，检测器对该组分的响应信号随时间变化所形成的峰形曲线称为该组分的色谱峰。3.峰高(h)色谱峰顶到基线的垂直距离。2023/11/64.保存值表示试样中各组分在色谱柱中滞留时间的数值。〔1〕时间表示的保存值保存时间〔tR〕：组分从进样到柱后出现浓度极大值〔即色谱峰顶值〕时所需的时间；调整保存时间〔tR＇〕：tR＇=tR－t0死时间〔t0〕：不与固定相作用的气体〔如空气〕的保存时间；2023/11/6〔2〕用体积表示的保存值保存体积〔VR〕：VR=tR×F0F0为柱出口处的载气流量，单位：mL/min。死体积〔V0〕：V0=t0×F0调整保存体积(VR＇)：VR＇=VR－V0=tR’×F02023/11/65.相对保存值r2，1组分2与组分1调整保存值之比：r2，1=t´R2/t´R1=V´R2/V´R1相对保存值只与柱温和固定相性质有关，与其他色谱操作条件无关，它表示了固定相对这两种组分的选择性。所以又称为选择因子。2023/11/66.区域宽度用来衡量色谱峰宽度的参数，有三种表示方法：〔1〕标准偏差()：即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。〔2〕半峰宽(Y1/2)：色谱峰高一半处的宽度Y1/2=2.355〔3〕峰底宽(Wb)：Wb=4〔4〕峰面积(A)：A=1.065hY1/2不对称色谱峰：A=1.065h(Y0.15+Y0.85)/22023/11/67.分配平衡

〔1〕分配系数〔partionfactor〕K组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相间分配到达平衡时的浓度〔单位：g/mL〕比，称为分配系数，用K表示，即：分配系数是色谱别离的依据。2023/11/6分配系数K的讨论一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢；试样一定时，K主要取决于固定相性质；同一个组份在不同的固定相上的分配系数K不同；选择适宜的固定相可改善别离效果；试样中的各组分具有不同的K值是别离的根底；某组分的K=0时，即不被固定相保存，最先流出。2023/11/6〔2〕分配比〔partionradio〕k在实际工作中，也常用分配比来表征色谱分配平衡过程。分配比是指，在一定温度下，组分在两相间分配到达平衡时的质量比：1.分配系数与分配比都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数，随别离柱温度、柱压的改变而变化。2.分配系数与分配比都是衡量色谱柱对组分保存能力的参数，数值越大，该组分的保存时间越长。3.分配比可以由实验测得。分配比也称：

容量因子(capacityfactor)；容量比(capacityfactor)；2023/11/6〔3〕分配比与分配系数的关系式中β为相比，即β=Vm/Vs。填充柱相比：6～35；毛细管柱的相比：50～1500。容量因子越大，保存时间越长。VM为流动相体积，即柱内固定相颗粒间的空隙体积；VS为固定相体积，对不同类型色谱柱，VS的含义不同:气-液色谱柱：VS为固定液体积；气-固色谱柱：VS为吸附剂外表容量；2023/11/6〔4〕分配比与保存时间的关系某组分的k值可由实验测得，等于该组分的调整保存时间与死时间的比值：〔5〕分配系数K及分配比k与选择因子r2,1的关系如果两组分的K或k值相等，那么r2,1=1，两组分的色谱峰必将重合，说明分不开。两组分的K或k值相差越大，那么别离得越好。因此两组分具有不同的分配系数是色谱别离的先决条件。2023/11/6根本保存方程可表示为：tR=t0(1+k)假设载气流量F0恒定，也可用保存体积表示，那么VR=Vm+KVs这就是色谱根本保存方程。上式说明，色谱柱确定后，Vm和Vs即为定值。由此可见，分配系数不同的各组分具有不同的保存值，因而在色谱图上有不同位置的色谱峰。〔5〕根本保存方程2023/11/6例：用一根固定相的体积为0.148mL，流动相的体积为1.26mL的色谱柱别离A,B两个组分，它们的保存时间分别为14.4min，15.4min，不被保存组分的保存时间为4.2min，试计算：

〔1〕各组分的容量因子

〔2〕各组分的分配系数

〔3〕AB两组分的选择因子rB,A解：〔1〕kA=(14.4min-4.2min)/4.2min=2.43kB=(15.4min-4.2min)/4.2min=2.67K=kβ=kVm/VsKA=kAVm/Vs=2.43×1.26mL/0.148mL=20.7KB=kBVm/Vs=2.67×1.26mL/0.148mL=22.7(3)rB,A=KB/KA=22.7/20.7=1.102023/11/6色谱流出曲线的意义由色谱流出曲线可以实现以下目的：〔1〕根据色谱峰的数目，可以判断试样中所含组分的最少个数。〔2〕根据色谱峰的保存值进行定性分析。〔3〕依据色谱峰的面积或峰高进行定量分析。〔4〕依据色谱峰的保存值以及峰宽评价色谱柱的别离效能。2023/11/6色谱分析根底第二节色谱理论根底一、塔板理论platetheory二、速率理论ratetheory三、别离度resolutionfundamentalofchromatographanalysis

fundamentalofchromatographtheory

2023/11/6色谱理论色谱理论需要解决的问题：色谱别离过程的热力学和动力学问题。影响别离及柱效的因素与提高柱效的途径，柱效与别离度的评价指标及其关系。组分保存时间为何不同？色谱峰为何变宽？组分保存时间：色谱过程的热力学因素控制；〔组分和固定相的结构和性质,如分配系数〕色谱峰变宽：色谱过程的动力学因素控制；〔两相中的运动阻力，扩散〕两种色谱理论：塔板理论和速率理论；2023/11/6塔板理论的假设：(1)在每一个平衡过程间隔内，平衡可以迅速到达；这一小段间隔的柱长称为理论塔板高度。(2)将载气看作成脉动〔间歇〕过程；(3)试样沿色谱柱方向的扩散可忽略；(4)分配系数在各塔板上是常数。一、塔板理论-柱别离效能指标1.塔板理论〔platetheory〕半经验理论；将色谱别离过程比较作蒸馏过程，将连续的色谱别离过程分割成屡次的平衡过程的重复〔类似于蒸馏塔塔板上的平衡过程〕；在每一个塔板上，被别离组分到达一次分配平衡。2023/11/6色谱柱长：L，虚拟的塔板间距离〔理论塔板高度〕：H，色谱柱的理论塔板数：n，那么三者的关系为：n=L/H理论塔板数与色谱参数之间的关系为：保存时间包含死时间，在死时间内不参与分配!单位柱长的塔板数越多，说明柱效越高。用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。2023/11/62.有效塔板数和有效塔板高度组分在t0时间内不参与柱内分配。需引入有效塔板数和有效塔板高度：2023/11/6例：用一根柱长为1m的色谱柱别离含有A，B，C，D四个组分的混合物，它们的保存时间tR分别为6.4min,14.4min,15.4min,20.7min,其峰底宽Wb分别为0.45min,1.07min,1.16min,1.45min。

试计算：各谱峰的理论塔板数。解：2023/11/63.塔板理论的特点和缺乏(1)当色谱柱长度一定时，塔板数n越大(塔板高度H越小)，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能那么越高，即使分配系数只有微小的差异，仍可获得好的别离效果。所得色谱峰越窄。

(2)不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。(3)柱效不能表示被别离组分的实际别离效果，当两组分的分配系数K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法别离。(4)塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效〔如塔板高度H〕的因素及提高柱效的途径。2023/11/6二、速率理论-影响柱效的因素1956年荷兰学者范弟姆特〔VanDeemter)等提出了色谱过程的动力学理论，他们吸收了塔板理论的概念，并把影响塔板高度的动力学因素结合进去，导出了塔板高度H与载气线速度u的关系。1.速率方程〔也称范.弟姆特方程式〕H=A+B/u+C·uH：理论塔板高度;u：载气的线速度(cm/s)减小A、B、C三项可提高柱效；存在着最正确流速；A、B、C三项常数各与哪些因素有关？2023/11/6A─涡流扩散项

A=2λdp

dp：固定相的平均颗粒直径λ：固定相的填充不均匀因子

固定相颗粒越小dp↓，填充的越均匀，A↓，H↓，柱效n↑。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。对于空心毛细管柱，A项为零。2023/11/6B/u—分子扩散项B=2γDgγ：弯曲因子，空心毛细管,γ=1；填充柱色谱,γ<1。Dg：试样组分分子在气相中的扩散系数〔cm2·s-1〕(1)存在着浓度差，产生纵向扩散;(2)扩散导致色谱峰变宽，H↑(n↓)，别离变差;(3)分子扩散项与流速有关，流速↓，滞留时间↑，扩散↑;(4)扩散系数Dg与组分及载气的性质有关：Dg∝(M载气)-1/2；M载气↑，B值↓。Dg∝〔M组分〕-1〔5〕扩散系数Dg随柱温升高而增加。2023/11/6

k为容量因子；Dg、Ds为扩散系数。

减小担体粒度，选择小分子量的气体作载气，可降低传质阻力。C·u—传质阻力项包括流动相传质阻力系数Cm和固定相传质阻力系数Cs即：C=〔Cm+Cs〕2023/11/62.柱效能跟流速的关系

在LC中,液体的扩散系数仅为气体的万分之一，那么速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，即：H=A+Cu故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如下图。2023/11/6载气流速高时：

传质阻力项是影响柱效的主要因素，流速

，柱效

。载气流速低时：

分子扩散项成为影响柱效的主要因素，流速

,柱效

。H-u曲线与最正确流速：由于流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效的总影响使得存在着一个最正确流速值，即速率方程式中塔板高度对流速的一阶导数有零值点。以塔板高度H对应载气流速u作图，曲线最低点的流速即为最正确流速。2023/11/6最正确流速uopt与最小理论塔板高度Hmin2023/11/63.速率理论的要点(1)组分分子在柱内运行的多路径与涡流扩散、浓度梯度所造成的分子扩散及传质阻力使气液两相间的分配平衡不能瞬间到达等因素是造成色谱峰扩展，柱效下降的主要原因。(2)通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提高柱效。(3)速率理论为色谱别离和操作条件选择提供了理论指导。说明了流速和柱温对柱效及别离的影响。(4)各种因素相互制约，如载气流速增大，分子扩散项的影响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使柱效下降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的影响，选择最正确条件，才能使柱效到达最高。2023/11/6三、别离度塔板理论和速率理论都难以描述难别离物质对的实际别离程度。即柱效为多大时，相邻两组份能够被完全别离。难别离物质对的别离度大小受色谱过程中两种因素的综合影响：保存值之差──色谱过程的热力学因素；区域宽度──色谱过程的动力学因素。色谱别离中的四种情况如下图：2023/11/6讨论：色谱别离中的四种情况的讨论：①柱效较高，△K(分配系数)较大,完全别离；②△K不是很大，柱效较高，峰较窄，根本上完全别离；③柱效较低，，△K较大,但别离的不好；④△K小，柱效低，别离效果更差。2023/11/6别离度的表达式：R=0.8：两峰的别离程度可达89%，有局部重叠；R=1：别离程度98%；R=1.5：达99.7%〔相邻两峰完全别离的标准〕。定义为相邻两组分色谱峰保存值之差与两个组分色谱峰峰底宽度总和一半的比值。2023/11/6色谱根本别离方程式令Wb(2)=Wb(1)=Wb〔相邻两峰的峰底宽近似相等〕，引入相对保存值和塔板数，可导出下式：2023/11/6讨论：〔1〕别离度与柱效的关系〔柱效因子n)别离度与柱效因子n的平方根成正比，r2,1一定时，增加柱长以增加柱效n，可提高别离度，但组分保存时间增加且峰扩展，分析时间长。增加n值得另一方法是减小柱的H值〔2〕别离度与选择因子r2,1的关系增大r2,1是提高别离度的最有效方法，计算可知，在相同别离度下，当r2,1增加一倍，需要的n有效减小10000倍。增大r2,1的最有效方法是选择适宜的固定相。2023/11/6例1：在一定条件下，两个组分的调整保存时间分别为85秒和100秒，要到达完全别离，即R=1.5。计算需要多少块有效塔板。假设填充柱的塔板高度为0.1cm，柱长是多少？解：r21=100/85=1.18n有效=16R2[r21/(r21—1)]2=16×1.52×(1.18/0.18)2=1547〔块〕L有效=n有效·H有效=1547×0.1=155cm即柱长为1.55米时，两组分可以得到完全别离。2023/11/6例2：在3.0m色谱柱上，别离A、B组分，其保存时间分别为14.0min、17.0min，不被保存的组分的保存时间为1.0min，B组分的峰底宽度Wb为1.0min。

计算A和B到达基线别离时〔R=1.5〕的柱长为多少？解：算出B组分的有效塔板数：再算出需要到达R=1.5时，需要的有效塔板数：2023/11/6由于n∝L，那么要到达基线别离需要的柱长为：所以L需=0.75m因此要到达基线别离，所需柱长为0.75m。2023/11/6色谱分析根底一、色谱定性分析qualitativeanalysisinchromatograph二、色谱定量分析quantitativeanalysisinchromatograph

第三节

色谱定性、定量分析gaschromatographicanalysis,GCqualitativeandquantitativeanalysisinchromatograph2023/11/6一、色谱定性鉴定方法1.利用纯物质定性的方法利用保存值定性：通过比照试样中具有与纯物质相同保存值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质及在色谱图中的位置。不适用于不同仪器上获得的数据之间的比照。2023/11/62023/11/6利用参加法定性：将纯物质参加到试样中，观察各组分色谱峰的相对变化。如果混合后峰增高而半峰宽并不相应增加，那么表示两者很可能是同一物质。利用双柱法定性：不同物质有可能在同一色谱柱上具有相同的保存值。所以应采用两根或多根性质显著不同的色谱柱进行别离，观察未知物和标准试样的保存值是否始终重合。2023/11/63.利用文献保存值定性利用相对保存值r21定性相对保存值r21仅与柱温和固定液性质有关，所以只要保证这两项与文献一致即可。在色谱手册中都列有各种物质在不同固定液上的保存数据，可以用来进行定性鉴定。这种方法要求找一个基准物质，一般选用苯、正丁烷、环己烷等作为基准物。所选用的基准物的保存值尽量接近待测样品组分的保存值。2023/11/64。用经验规律进行定性分析

当没有待测组分的纯标准样时，可用文献值定性，或用气相色谱中的经验规律定性。〔l〕碳数规律大量实验证明，在一定温度下，同系物的调整保存时间的对数与分子中碳，原子数成线性关系，即式中A1和C1是常数，n为分子中的碳原子数〔n≥3〕。该式说明，如果知道某一同系物中两个或更多组分的调整保存值，那么可根据上式推知同系物中其它组分的调整保存值2023/11/6〔2〕沸点规律同族具有相同碳数碳链的异构体化合物，其调整保存时间的对数和它们的沸点呈线性关系，即式中A2和C2均为常数，Tb为组分的沸点〔K〕。由此可见，根据同族同数碳链异构体中几个组分的调整保存时间的对数值，可求得同族中具有相同碳数的其他异构体的调整保存时间。2023/11/65.根据保存指数定性又称Kovats指数(Ⅰ)，是一种重现性较好的定性参数。测定方法：所选固定相和柱温应与文献一致将正构烷烃作为标准，规定其保存指数为分子中碳原子个数乘以100〔如正己烷的保存指数为600〕。被测物质的保存指数〔IX〕是通过选定两个相邻的正构烷烃通过实验算得，其分别含有Z和Z＋1个碳原子。被测物质X的调整保存时间应在相邻两个正构烷烃的调整保存值之间如下图：2023/11/6保存指数计算方法求出未知物的保存指数，然后与文献值对照，即可实现未知物的定性。2023/11/6例：在同一根色谱柱上测出：正庚烷，正辛烷和未知物的调整保存时间分别为14.08s，25.11s和16.32s，试计算它们的保存指数I。解：由定义可知：I庚=100×7=700I辛=100×8=800由求出保存指数与文献保存指数对照可知未知物为甲苯。2023/11/66.与其他分析仪器联用的定性方法小型化的台式色质谱联用仪〔GC-MS；LC-MS〕色谱-红外光谱仪联用仪；组分的结构鉴定SampleSample

58901.0DEG/MINHEWLETTPACKARDHEWLETTPACKARD5972AMassSelectiveDetectorDCBA

ABCDGasChromatograph(GC)MassSpectrometer(MS)SeparationIdentificationBACD2023/11/6二、色谱定量分析方法在一定操作条件下，分析组分i的质量〔mi〕或其浓度与检测器的响应信号〔色谱图上表现为峰面积Ai或峰高hi〕成正比：mi=fiAi这就是色谱定量分析的依据。由此可见，在定量分析中需要：〔1〕准确测量峰面积；〔2〕准确求出比例常数fi〔称为定量校正因子〕〔3〕根据上式正确选用定量计算方法，将测得组分的峰面积换算为质量分数。2023/11/6峰面积的测量〔1〕峰高〔h〕乘半峰宽〔W1/2〕法：当色谱峰为对称峰时，近似将色谱峰当作等腰三角形。此法算出的面积是实际峰面积的0.94倍：A=1.065h·W1/2〔2〕峰高乘平均峰宽法：当峰形不对称时，可在峰高0.15和0.85处分别测定峰宽，取其平均值作为平均峰宽。由下式计算峰面积：A=h·〔W0.15+W0.85〕/2

〔3〕自动积分和微机处理法2023/11/62.定量校正因子试样中各组分质量与其色谱峰面积成正比，即：

mi=

fi‘

·Ai

绝对校正因子：比例系数f

i

，单位面积对应的物质量：

f

i‘=mi/Ai

相对校正因子f

i

：即组分的绝对校正因子与标准物质的绝对校正因子之比。当mi、mS以摩尔为单位时，所得相对校正因子称为相对摩尔校正因子〔fM〕,用表示；当mi、mS用质量单位时,称为质量校正因子，以〔fm〕,表示。2023/11/63.常用的几种定