氧化型谷胱甘肽的制备

氧化型谷胱甘肽的制备

自由氨基酸是身体的正常代谢产物，具有很强的氧化反应能力。过量的自由基会对蛋白质、核酸等造成损伤,从而引起相关疾病。谷胱甘肽是细胞内的天然抗氧化剂,参与完成对自由基(主要为氧自由基)的清除,其自身则被氧化成为氧化型谷胱甘肽(oxidizedglutathione,GSSG,1)。1在谷胱甘肽还原酶的作用下被还原为还原型谷胱甘肽(reducedglutathione,GSH,2),使体内两种形态的谷胱甘肽维持动态平衡。2由于其显著的保肝作用,已广泛用于药物性肝损伤及其他肝脏疾病的临床治疗。金春英等报道1对2清除自由基具有协同作用。作为免疫增强剂,1已于2005年在俄罗斯批准上市(商品名Glutoxim®),用于化疗、放疗和抗感染联合用药。本研究考察了以2为原料制备1的工艺,并研究了1对小鼠急性肝损伤的治疗作用。1中药-中酰氨基酚试剂515-2487型高效液相色谱仪(美国Waters公司)。2原料(美国Amresco公司,含量98.2%,批号1467B509);1二钠盐对照品(美国Sigma公司,含量99.1%,批号085K7435);注射用2(重庆药友制药有限公司,规格1.2g,批号1005030);对乙酰氨基酚(3,含量98.4%,批号F20080519)、过氧化氢(中国医药集团化学试剂公司);谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所);其他试剂均为分析纯。雄性ICR小鼠[体重18~20g,上海斯莱克实验动物有限责任公司,实验动物生产许可证SCXK(沪)2007-0005]。2方法和结果2.1总过氧化氢检测磷酸二氢钠溶液色谱柱TSKgelODS-100V柱(4.6mm×250mm,5uf06dm);流动相0.025mol/L磷酸二氢钠溶液(pH3.15);柱温30℃;流速1ml/min;检测波长210nm;进样量20uf06dl。分别取1二钠盐对照品和2原料适量,用水溶解制成1mg/ml的溶液1和溶液2;量取过氧化氢溶液适量并用水稀释得浓度为0.06%的溶液3。将溶液1、2和3等体积混匀得混合溶液,在本色谱条件下的色谱图见图1,可见三者分离度良好。2.21制装剂的研究2.2.1过氧化氢用于氧化配制200g/L的2溶液,共5份。将其中1份直接加水稀释至150g/L,测得pH为3.0。其余4份加5mol/L氢氧化钠溶液调节pH为4.0、5.0、6.0和7.0,然后加水使其终浓度为150g/L。每份取10ml于冰浴下以120r/min搅拌10min,滴加30%过氧化氢1ml,反应0.5、1、1.5和2h后取样并立即稀释150倍进行HPLC分析,计算1的峰面积百分比。试验重复3次,结果见表1。结果表明,当过氧化氢终浓度为3%时,在pH5~6条件下对2的氧化效率较高。在中性条件下,氧化反应不彻底,推测其原因为过氧化氢在中性条件下易分解,导致反应体系中氧化剂的量降低。2.2.2过氧化氢对样品的氧化速度影响取220g,加水30ml溶解,搅拌并滴加5mol/L氢氧化钠溶液调至pH5.1,补加水至总体积为40ml并均分成4份。将其中3份的浓度稀释至400、300和200g/L,复测pH并将之调节为5.1。各份样品置冰浴中,照“2.2.1”项下加入过氧化氢进行反应并测定。试验重复3次,结果见表2。可见在过氧化氢浓度一定时,2浓度对氧化速度有较大影响。2浓度小于300g/L时,由于过氧化氢相对更加过量,在2h内就能氧化完全。在高浓度(400g/L以上)时,虽然进一步增加过氧化氢浓度可能加快反应效率,但综合考虑2的溶解度、反应体系的体积和后处理,及过氧化氢的用量等因素,在制备1时反应物浓度为300g/L较合适。2.2.3过氧化氢用于合成其他双环[3.2.2]取210g,加水30ml溶解,搅拌并滴加5mol/L氢氧化钠溶液调至pH5.5,补加水至总体积为40ml并均分成4份。冰浴下搅拌10min后分别加入30%过氧化氢0.5、1、2和3ml,即过氧化氢终浓度分别为1.5%、3%、5%和7%。继续搅拌反应并照“2.2.1”项下方法取样测定。试验重复3次,结果见表3。结果显示,pH为5.5、2浓度为250g/L时反应速率与过氧化氢的浓度呈正相关。采用终浓度3%可最大量地节约过氧化氢用量和反应时间。2.2.4无水乙醇用量的制备将“2.2.3”项下过氧化氢终浓度为3%、5%和7%并反应2h的三组反应产物合并,得1溶液约30ml,缓慢加入无水乙醇100ml,搅拌得白色1沉淀。过滤,滤饼再加入无水乙醇100ml,搅拌5min后过滤,重复3次以充分去除过氧化氢和水分。将所得白色沉淀于40℃减压干燥3h,得粉末状17.17g(收率95.9%,HPLC分析其纯度为99.5%),色谱图见图2。加注射用水25ml溶解后进行无菌分装、冻干得注射用1,备用。2.31模型大鼠血清中alt和ast活性的检测将48只雄性ICR小鼠随机分成6组,每组8只,作为正常对照组、3(300mg/kg)致肝损伤模型组、肝损伤+1组(120和60mg/kg)、肝损伤+2组(120和60mg/kg)。用生理盐水将注射用1和注射用2分别现配得浓度为1.2%和0.6%的溶液,将3配制成1.5%的溶液。正常组和肝损伤模型组以10ml/kg剂量连续6d腹腔注射(ip)生理盐水,其余4组则以ip给予等剂量的相应药物。d6给药1h后,除正常组外各组按0.2ml/10g剂量ip给予3溶液,动物禁食24h后经眼眶取血约700uf06dl,常规制备血清并测定ALT和AST活性。对试验数据进行统计学处理,各组间的比较采用两样本均数的t检验,结果见表4。结果表明,3在300mg/kg剂量下模型组转氨酶显著升高,各给药组都有明显的降低转氨酶活性作用。1或2在60和120mg/kg的剂量下均可显著降低ALT和AST水平,并且两者在降低转氨酶活性上无显著差异。3反应条件的确定1、2与谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽硫转移酶、谷胱甘肽还原酶等共同构成生物体抗氧化防御系统。当肝脏中外源药物等物质代谢过程中产生的亲电子基、自由基等有毒物质超过肝内2水平时,肿瘤坏死因子uf061、Caspase-3等表达上调,从而加速肝细胞损伤和凋亡。2的活性巯基能与上述有害物质结合而发挥解毒保肝作用。鉴于体内1和2能在酶的作用下相互转变,及临床上2广泛使用,尤其是在肝病治疗方面的应用,本研究探讨了1的体内生物活性。多肽氧化产生二硫键的方法主要有空气氧化法、过氧化氢氧化法、铁氰化钾氧化法和碘氧化法等。文献报道2可经O2氧化、酶催化及过氧化氢氧化等方法制备1。综合考虑氧化方法的氧化效率、成本、残余氧化剂的去除和操作简便性等因素,本研究选择过氧化氢作为制备1的氧化剂。主要考察了过氧化氢氧化法制备1的工艺,并优化了反应参数。初步确定最佳反应条件为:2浓度为200~300g/L,反应为pH5.0~6.0,过氧化氢终浓度为3%,2h内能反应完全,所得1纯度大于99%,总收率大于95%。氧化完成后能