细菌双杂交系统的研究进展

细菌双杂交系统的研究进展

karimova等人在双重混合系统和双重哺乳动物细胞培养系统之后成立了细菌双杂交系统。这一方法是根据百日咳博代杆菌(Bordetellapertussis)中cya基因编码的钙调蛋白(CaM)依赖性腺苷酸环化酶,其激活区可以分成T18和T25两个相对独立的功能片段。将这两种片段引入大肠杆菌DHP1(cya-)中作为两个独立的实体表达,它们不能彼此识别与作用,因此不能互补大肠杆菌DHP1的cya-缺陷型性状,表现为β-半乳糖苷酶活性很低,生长在MacConkey/麦芽糖平板上的菌落呈白色。若这两个功能区分别与一对可相互作用的蛋白质融合表达,它们可形成有功能的腺苷酸环化酶,互补大肠杆菌DHP1的cya-缺陷型,使菌株β-半乳糖苷酶活性上升,生长在MacConkey/麦芽糖平板上菌落显红色。因此应用这个双杂交系统研究蛋白质间的相互作用即可根据β-半乳糖苷酶和麦芽糖酶的活力来检测。我们选用细菌双杂交系统研究阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)固氮调节蛋白NifL和NifA的相互作用,发现按MacConkey/麦芽糖平板显色及β-半乳糖苷酶活性测定时有假阳性的现象,为此我们设计了一套方法直接检测大肠杆菌DHP1菌体抽出液中百日咳博代杆菌的腺苷酸环化酶活力,从而排除了假阳性的干扰。我们认为这一改进在应用细菌双杂交系统研究蛋白质相互作用中值得采用。1材料和方法1.1养基、培养基钙调蛋白(CaM)、咖啡因、cAMP及MacConkey培养基由Sigma公司生产。HSGF-254型硅胶板为山东烟台硅胶开发厂产品。LB为丰富培养基。抗生素的使用浓度为氨苄青霉素(Ap)100mg/L,氯霉素(Cm)30mg/L。1.2pel1克隆及酶切筛选大肠杆菌菌株DHP1和质粒pT18-zip及pT25-zip由法国巴斯德研究所D.Ladant博士赠送。pT18和pT25分别由pT18-zip和pT25-zip切掉两个KpnI位点间的zip片段所得。将PCR所得的阴沟肠杆菌nifL基因克隆到pT18的KpnI位点,使之与T18处于相同的阅读框即得pEL1。pEL1用KpnI酶切后,回收含有nifL基因的DNA片段并克隆到pT25的KpnI位点上,酶切筛选插入方向正确的克隆即为pEL11。pEL1和pEL11在大肠杆菌中可分别表达融合蛋白T18-NifL和T25-NifL。pEA1是将阴沟肠杆菌nifA基因的PCR产物按同一阅读框的形式克隆到载体pT25中的PstI和BamHI之间所得,可以表达融合蛋白T25-NifA。DHP1825、DHP1820、DHP1025、DHP1810、DHP1020及DHP1212都是含有不同质粒的DHP1菌株(表1)。1.3-半乳液酶活性测定参考Miller的方法。1.4分离人细胞中的粗酶液基本参照Ladant和Ramachandran的方法。挑取单菌落到200mlLB培养基中,37℃培养过夜,加入IPTG至终浓度0.5mmol/L,于28℃诱导培养4～6h,离心收集菌体。用含0.1mol/LMgSO4的Tris-HCl缓冲液(pH7.4)重新悬浮,在冰浴中超声波破碎细胞。于4℃离心去沉淀,收集上清液在冰浴中用上述Tris-HCl缓冲液透析4～5h,中间更换2～3次透析液,即得粗酶液。根据Bradford法测定粗酶液中蛋白质的浓度。腺苷酸环化酶活性测定的反应总体积为300μl,内含1mmol/LATP,10mg/LBSA,0.2mmol/LCaCl2,33mmol/LNaF,饱和的咖啡因3μl,6uCaM,加入粗酶液使各样品的蛋白质总量都为140μg。样品于28℃水浴中反应30min,经沸水浴煮2min以终止反应。离心去沉淀,上清液中加入40μl0.25mmol/LBa(OH)2和40μl0.25mmol/LZnSO4,混匀,离心收集上清液即为样品。取20μl分别滴加在HSGF-254型硅胶板上,以异丁酸∶氨水∶水=66∶1∶33作为展层剂,通过薄层层析法展层后,紫外检测cAMP的含量。2结果2.1红色活性剂将已构建含T18-NifL、T25-NifL或T25-NifA片段的融合质粒和只含T18或T25片段的质粒分别共转化DHP1菌株,在MacConkey/麦芽糖平板培养基中作选择生长,结果如图1所示,菌株(a)DHP1825(含T18和T25)和(b)DHP1820(含T18和T25-NifA)的菌落呈黄色,而(c)DHP1025(含T18-NifL和T25),(d)DHP1810(含T18和T25-NifL)及(e)DHP1020(含T18-NifL和T25-NifA)等菌落都不同程度地显红色,与阳性对照的(f)DHP1212(含T18-zip和T25-zip)相似。DHP1025及DHP1810是只含有T18-NifL或T25-NifL一种融合蛋白的对照菌株,也可以部分恢复DHP1菌株发酵麦芽糖的能力而使菌落呈浅红色的假阳性。假阳性结果的出现,干扰了细菌双杂交系统中应用MacConkey/麦芽糖平板显色法证实NifL与NifA之间是否相互作用。2.2tg-nifl和s15-nifa的体外-半乳糖苷酶活性与MacConkey/麦芽糖平板显色的结果相似,DHP1025(含T18-NifL和T25)和DHP1810(含T18和T25-NifL)的β-半乳糖苷酶活性虽然比DHP1020(含T18-NifL和T25-NifA)的活性明显要低,但较阴性对照菌株DHP1825(含T18和T25)和菌株DHP1820(含T18和T25-NifA)的β-半乳糖苷酶活性高出一倍以上(见表1)。说明NifL和NifA分别与T18和T25融合后确实可导致DHP1菌株的β-半乳糖苷酶活性明显上升,但由于含单独的T18-NifL或T25-NifL的DHP1菌株β-半乳糖苷酶活性也有一定的上升,因此根据测定DHP1菌株的β-半乳糖苷酶活性也不能明确作出NifL与NifA是否发生相互作用的结论。2.3cdhp十20和两组融合蛋白的细胞融合蛋白检测由于细菌双杂交系统中应用的是百日咳博代杆菌的腺苷酸环化酶与大肠杆菌的腺苷酸环化酶特性不同,它具有CaM依赖型的特性,加入CaM后腺苷酸环化酶活性可以上升约1000倍,并导致cAMP的积累。根据这一特性我们抽取各菌株的粗酶液,检测它们合成cAMP的能力,以确定蛋白质间相互作用的真伪性。结果如图2所示,在菌株DHP1020(含T18-NifL和T25-NifA)的粗酶液中加入CaM后,可以检测到大量的cAMP产生(泳道5),与阳性对照菌株DHP1212(含T18-zip和T25-zip)相似(泳道3),表明它们具有依赖CaM的腺苷酸环化酶活性。若菌株只含一种融合蛋白如DHP1025(含T18-NifL和T25)或DHP1810(含T18和T25-NifL)等,它们的粗酶液中加入CaM后,仍然检测不到cAMP产生(泳道7,9),与阴性对照的DHP1825(含T18和T25)菌株相似(泳道11),表明它们都没有依赖CaM的腺苷酸环化酶活性。这一结果说明DHP1025及DHP1810虽然在MacConkey/麦芽糖平板上菌落呈浅红色,并有较高的β-半乳糖苷酶活性,但它们并不是由于两种蛋白质相互作用的结果,即不是由T18和T25两个融合片段的整合,形成有专一CaM依赖型活性的腺苷酸环化酶产生的cAMP,从而激活某些cAMP-CAP依赖型的与分解代谢有关的基因表达,包括与半乳糖及麦芽糖代谢有关的酶产生。3pahs-elisa法实验结果显示,DHP1中表达融合蛋白T25-NifA时,菌株表现的性状与含空载体的阴性对照菌株相似,而DHP1中无论NifL与T18或T25融合表达,都会产生β-半乳糖苷酶活性上升以及菌落在MacConkey/麦芽糖平板上显红色的假阳性结果。我们推测阴沟肠杆菌NifL本身可能具有一定的腺苷酸环化酶活性,它可以合成少量的cAMP互补大肠杆菌DHP1的cya-突变型,但阴沟肠杆菌NifL的腺苷酸环化酶与百日咳博代杆菌的腺苷酸环化酶性质不同,它不是CaM依赖型,因此在加入CaM后cAMP的量并不增加,通过薄层层析法直接检测cAMP形成的量,可以将二者区别,从而有效地排除了假阳性的干扰。用薄层层析法检测生成的cAMP,反应中必须加入适量的NaF和咖啡因。NaF可抑制ATPase的活性,防止ATP被ATPase降解,确保反应过程中底物ATP的浓度始终维持在较高的水平。咖啡因能抑制3′,5′-cAMP磷酸二酯酶对cAMP的降解,保证生成的cAMP的积累。由于在细菌的体内存在大量具有紫外吸收特性的物质,可能会影响薄层层析对cAMP的分离或干扰对cAMP的检测,因此必需先经过透析去除细菌粗酶液中各种游离小分子的干扰,包括内源的ATP、ADP、AMP和cAMP等。再利用ZnSO4-Ba(OH)2沉淀法,除去反应中加入的ATP和由于ATPase抑制不彻底而产生的少量ADP以及一些其他的可被沉淀且具有紫外吸收特性的物质。经过上述处理后,层析时就很容易检测到cAMP的生成。本文使用薄层层析法代替ELISA法检测生成cAMP的量,使实验成本及对实验仪器的要求明显降低,实验结果用照片代替了数据,因此也更直观。细菌双杂交系统是在酵母双杂交系统的基础上建立的较方便、快速和灵敏的检测蛋白质间相互作用的方法。作为一种新建立起来的研究蛋白质相互作用的系统,它具有以下优点:第一,大肠杆菌的生长速度快,大大缩短了实验周期;第二,该系统通过是否形成有活性的腺苷酸环化酶来判断两种蛋白质是否相互作用,因此可以将它们同T18或T25片段形成的融合蛋白纯化出来,检测融合蛋白混合液的腺苷酸环化酶活性,从体外研究蛋白质间相互作用,并可直接研究环境因子或其他分子等对蛋白质相互作用可能产生的影响;第三,如果被研究的两种蛋白质之一自身具有腺苷酸环化酶活性(非CaM依赖型特性),在应用细菌双杂交系统时就不可避免地会产生假阳性的干扰,可以根据我们上面介绍的方法,有效地排除假阳性的干扰。这些优点必然使细菌双杂交系统在研究蛋白质相互作用方面具有广泛的应用前景。另外,由于细菌双杂交系统与酵母双杂交系统相比,更类似于