家畜螨病诊断与防控技术规范

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（规范性）

实验室检查显微镜检测痂皮的采集疥螨病痂皮的采集剪去患部和健康部皮肤交界处的毛后，采用经火焰消毒后的小刀垂直于皮肤面用力刮取交界处痂皮，直至刮处皮肤微有出血痕迹，刮破处涂碘伏消毒，将刮取物收集到容器内，待检。痒螨病与足螨病痂皮的采集用镊子夹取患病部皮肤表面的痂皮或者用消毒小刀用力刮取患病部皮肤表面的痂皮，取痂皮处涂碘伏消毒，将痂皮收集到容器内，待检。镜检热源发将采集的痂皮放入平皿内，将平皿放入25～37℃的恒温箱中0.5～1h后，将平皿置于显微镜下检查，若检测到螨虫和/或螨卵则判定为阳性。直接图片检查法将采集的痂皮放置于载玻片上，滴加1滴5%甘油（丙三醇）水溶液，加盖载玻片，搓压玻片至病料散开，分开载片，加盖片后置显微镜下检查，若检测到螨虫和/或螨卵则判定为阳性。浓集法当螨虫数量较少时，可采用浓集法收集螨虫镜检。将刮取的较多痂皮放入10%氢氧化钠溶液并浸泡过夜或加热煮5min左右，待其溶液自然沉淀15min，取沉淀物镜检。或将上述沉淀物转入试管中，再加入60%硫代硫酸钠溶液，试管口加盖玻片，静置5～10min后，取盖玻片镜检。若镜检到螨虫和/或螨卵则判定为阳性。血清学检测方法采用间接酶联免疫吸附试验（iELISA）检测待检血清样品中相应螨虫的IgG抗体。操作方法抗原制备疥螨重组烯醇化酶蛋白（rSar-Eno）的制备采用RT-PCR方法从兔源疥螨cDNA文库中扩增疥螨Sar-Eno基因，将目的片段连接到pET32a（+）载体，并经公司测序核实序列正确后转入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，采用1.0mMIPTG37℃诱导8h后，采用SDS电泳验证表达情况（rSar-Eno约65kDa）。进一步将正确表达的菌株扩大培养和诱导表达，将菌液离心、超声破碎、镍柱纯化、透析及超滤后，获得纯化后的疥螨重组烯醇化酶蛋白（rSar-Eno），采用BCA试剂盒测定蛋白浓度后，分装保存于-80℃备用。绵羊痒螨重组丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白（rPsoc27）的制备采用RT-PCR方法从绵羊痒螨cDNA文库中扩增Psoc27基因，将目的片段连接到pET32a（+）载体，并经公司测序核实序列正确后转化进大肠杆菌BL21（DE3）的感受态细胞，采用1.0mMIPTG37℃诱导8h后，采用SDS电泳验证表达情况（rPsoc27约75kDa）。进一步将正确表达的菌株扩大培养和诱导表达，将菌液离心、超声破碎、镍柱纯化、透析及超滤后，获得纯化后的绵羊痒螨重组丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白（rPsoc27），采用BCA试剂盒测定蛋白浓度后，分装保存于-80℃备用。抗原包被聚乙烯板用0.1M的碳酸盐缓冲液（pH9.6）将的抗原稀释到最佳浓度（rSar-Eno14.5μg/mL，rPsoc2746.0μg/mL）后加入聚乙烯板，每孔100μL，4℃包被过夜。次日，弃孔内液体，每孔加入PBST缓冲液（0.01MPBS+0.05%Tween-20，pH7.4）300μL，洗板3次，每次5min，拍干；加封闭液每孔加5%脱脂奶粉（W/V，5g脱脂奶粉+100mLPBS）300μL，37℃封闭1.5h。弃孔内液体，洗涤同。加待检血清每孔加入用PBS缓冲液（0.01MPBS，pH7.4）稀释的待检血清100μL（rSar-Eno=1:640；rPsoc27=1:100），每板同时设置标准阳性孔、标准阴性孔以及空白对照孔，分别加入标准阳性血清、标准阴性血清以及稀释液PBS作为对照。37℃温育1h后，弃孔内血清，洗涤同。加酶标二抗用PBS缓冲液（0.01MPBS，pH7.4）将辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗稀释至工作浓度，加入100μL，37℃温育1h。弃孔内液体，洗涤同。加底物显色每孔加入底物TMB（3，3’，5，5’-四甲基联苯胺）溶液100μL，37℃避光温育20min。终止反应每孔加入2M硫酸（H2SO4）50μL终止反应，20min内用酶标仪测XX果。结果判定以空白孔调零，用酶标仪测定450nm的吸光值（OD值），若阳性对照OD值/阴性对照OD值的比例大于2.1，则实验结果成立。P为待检血清孔OD值，N为阴性对照孔OD值，以P/N≥2.1判为阳性，P/N<2.1判为阴性。分子生物学检查方法方法采用聚合酶链式反应（PCR）技术，以线粒体COXI基因为靶基因，对螨虫特异性DNA片段进行常规PCR检测。操作方法DNA的提取根据市售的微量基因组DNA提取试剂盒说明书分别提取附录痂皮和疥螨虫体（事先在遇冷的研钵中加液氮研成粉末）的DNA，备用。PCR扩增扩增总体积为25μL，包括PCRMixture12.5μL，待检样品DNA模板1.0μL，上、下游引物各1.0μL（10pmol/μL，引物序列5’-GTGTGGAACTGGTAGAGG-3’，5’-CAGATCAAGCAAAAAGAGTTAAG-3’），灭菌蒸馏水加至25.0μL。同时设置疥螨DNA的阳性对照组和设置灭菌蒸馏水的阴性对照组。扩增条件如下：94 °C预变性3min；94 °C变性30 s，54°C复性20 s，72 °C延伸20s，35个循环；72 °C延伸8min；8℃储存10min。产物预期大小为212bp。结果判定取6μLPCR产物（包括待检样品、阳性对照、阴性对照）及5μLDNA标准Marker，加入1.8%X脂糖凝胶板的孔内（含Goldview核酸染料），经5V/cm电泳，电泳20min，于紫外凝胶成像仪或凝胶成像系统中观察结果。实验结果成立条件：XX性对照出现212bp扩增条带，空白对照未出现目的条带。在实验结果成立的情况下，待检样品出现预期大小（212bp）条带即为阳性（见图E.1）。PCR方法标准阳性扩增结果注：M，DL2000标准分子量（TakaRa）;1，标准阳性扩增结果;2，阴性对照若需要进一步确认检测结果，可将电泳检测呈阳性的PCR剩余产物送公司进行测序，疥螨COXI基因参考序列（212bp）为：GTGTGGAACTGGTAGAGGAACTGGCTGAACTATTTATCCTCCTTTATCTAGAATCACTTATCATTCAAATATGTCTGTAGATTTTACAATTGTAAGATTACATATTGCTGGAATTTCTTCTATTTTAAGTTCTATCAATTTTATTGTAACTATTTATAATATAAAAATAAAAGGAATAAGATGATCAAACTTAACTCTTTTTGCTTGATCTG参考文献[1]郝桂英，杨光友，赖松家，等.

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