响应面法优化茶叶黄酮提取工艺及其抗氧化活性研究

响应面法优化茶叶黄酮提取工艺及其抗氧化活性研究

茶是科茶园的科植物。茶叶不仅具有提神清热、消食化痰、解毒醒酒、降火止痢等药理作用,现代研究表明茶叶还具有降血糖、降低胆固醇、抗衰老、抗菌、抗病毒、防癌等多种生理功能。绿茶中的多种黄酮类物质具有特殊的生物效能,对人类健康有重要作用,它可以起到单重态氧清除剂的作用,并对过敏、感染、高血压、肿瘤和AIDS等疾病具有辅助治疗作用。黄酮物质具有清除体内自由基、防癌、预防心血管疾病等生物活性功能,常用于保健品和药品,替代合成抗氧化剂;氧自由基是引起人体衰老、细胞损伤某些疾病发生的主要原因之一。目前常用的食品抗氧化剂(如BHT、BHA)大多是合成品,会引发食品安全性问题。天然抗氧化剂具有安全、无毒等优点。本文利用废弃的粗老绿茶研究了茶叶黄酮在聚乙二醇/盐双水相体系中的分配行为,通过单因素试验和响应面法,探讨了聚乙二醇和盐的种类及用量,温度、pH等对双水相系统及茶叶黄酮萃取率的影响,优化工艺条件;所得黄酮再研究其抗氧化活性,旨在为茶叶黄酮抗氧化功能的开发、利用以及食品的贮藏保鲜提供技术依据。1材料和设备1.1仪器、试剂和仪器茶叶采用温州的粗老绿茶;2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、二苯基苦味酰基苯肼(DPPH·):美国Sigma公司;聚乙二醇(PEG)(不同分子量)及其他试剂购于国药集团,均为分析纯。紫外分光光度计:北京普析通用仪器有限公司;KQ-300VDV型数控超声波清洗器:昆山市超声仪器有限公司;RE52CS旋转蒸发仪:上海亚龙生化仪器厂;Scientz-10N冷冻干燥机:宁波新芝生物科技股份有限公司。1.2测试方法1.2.1标准曲线的绘制1.2.2超声提取法将茶叶洗净、干燥、粉碎得茶叶末,称取一定质量的茶叶(1g),在超声波功率280W,温度50℃下浸提,乙醇体积分数50%,料液比1∶20,超声提取20min,直至浸提完全,将浸提液加入到1000mL的容量瓶中,定容,得浸提液。以50%乙醇为参照液于波长273nm处测其吸光度值得其质量浓度0.0442mg/mL。1.2.3黄酮含量的测定在刻度具塞离心管中加入一定质量的PEG、盐、浸提液、蒸馏水,溶解,形成双水相体系。所得体系PEG富集于上相,下相为水相。上相为亮黄色,大部分黄酮类物质分布于此,下相为深黄色,多数杂质和色素分布于此,分别测定上、下相体积,然后用紫外分光光度计于波长273nm处测其吸光度值,求得双水相中茶叶黄酮的含量。R=Vt/Vb,K=Ct/Cb,Y=(1+1/RK)-1×100%式中:R为相比;Vt、Vb为上、下相体积(mL);K为茶叶中黄酮的分配系数;Ct、Cb为上、下相茶叶中黄酮的质量浓度(mg/mL);Y为得率(%)。1.2.4peg用量的测定在双水相中,影响茶叶黄酮分配的因素有很多。量取1mL茶叶浸提液,以pH=9,在30℃水浴中提取20min为基准,分别考察PEG不同分子量及其不同量、组成双水相不同盐及其不同质量分数、pH、温度及氯化镁的添加量,以茶叶黄酮在双水相的上相中的得率为指标,以确定影响较大的因素,每组试验重复3次,取平均值作图。1.2.5响应面优化试验设计根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理,综合单因素试验结果,选取对茶叶黄酮在双水相中分配行为影响较大的3个因素,采用3因素3水平的响应面分析方法进行试验设计,以茶叶黄酮在上相中的得率为响应值,每组试验重复3次,取平均值,运用SAS数据处理软件进行响应面分析,对反应条件进行优化。试验因素和水平见表1。1.2.6dpph清除活性测定茶叶黄酮的还原能力:2.5mL不同浓度样品与2.5mL0.2mol/L磷酸钠缓冲液(pH6.6)和2.5mL1%铁氰化钾混合,50℃保温20min,加入2.5mL10%三氯乙酸,混和物离心10min(3000r/min),上清液(5mL)加5mL去离子水,再加1mL0.1%三氯化铁混合,静止10min后在波长700nm处测吸光度。其吸光度的大小即反映了其还原能力的大小;用BHT和Vc作比较。茶叶黄酮对DPPH清除力的测定:DPPH分析法被广泛用于清除自由基物质性质的研究。DPPH在有机溶剂中是一种稳定的自由基,当有清除剂存在时,其孤电子被配对,吸光度下降或减弱。通过测定吸收减弱的程度,可评价自由基清除剂的活性。取一定浓度的样品溶液2mL,加入2mL用乙醇配制的0.8mmol/mLDPPH溶液,用力振摇混匀后置暗室中静置30min,于波长517nm处测定吸光度;用BHT和Vc作比较,计算DPPH清除率:DPPH清除率(%)=[1-(Ax-Ax0)/A0]×100式中Ax表示加入样品溶液后的吸光度;Ax0表示样品溶液本底的吸光度;A0表示空白对照液的吸光度。2结果与分析2.1单因素试验的结果和分析2.1.1黄酮分配实验结果取5mL质量分数为15%的Na2SO4和3g不同分子量的PEG分别组成双水相体系作为研究体系,在pH为9,温度为30℃的条件下,考察茶叶中黄酮的分配情况,见图1。2.1.2不同质量的peg600对黄酮类化合物的分配有影响2.1.3盐和盐的浓度对黄酮类化合物的分配有影响2.1.4ph值对分配系数k的影响取5mL质量分数为15%的Na2SO4和质量为6g的PEG600组成双水相体系,在温度为30℃,pH值2～12之间,用盐酸和NaOH调节pH值,考察不同pH值对分配系数(K)的影响,结果如图4所示。2.1.5升温对茶叶黄酮分配的影响取5mL质量分数为15%的Na2SO4和质量为6g的PEG600组成双水相体系,在pH为5,温度在25～45℃之间,用恒温水浴锅提供合适的温度环境,以考察不同温度对茶叶黄酮分配行为的影响,结果如图5所示。升温有利于双水相的形成。原来还没来得及分相的体系,在温度提高后相分离速度随着温度的升高而加快,而R值则随着温度的升高而降低,这主要是因为温度升高时,PEG在水中的溶解度增加,PEG分子部分转移到富含水的下相,导致上相体积减小、下相体积增大。由图5可知,最合适的温度是30℃时茶叶黄酮得率最高。2.1.6mgcl2添加量对黄酮分配的影响以6gPEG600和5mL的15%Na2SO4作为研究体系,在pH值5、温度30℃时,考察MgCl2的添加量对茶叶黄酮分配的影响。无机盐的加入改变了两相间的电位差,从而缩短分相时间,提高了相分离速度,也可使一些原来不分相的体系分相,并降低R值,茶叶黄酮的K值增大。2.2试验结果及反应分析2.2.1黄酮在双水相系统中的分配性能分析根据响应面试验设计3次试验所得茶叶黄酮在上相中的得率的平均值为响应值,试验结果见表2。2.2.2回归方程和模型分析以Y提取率(%)为响应值,根据实验结果,用SAS统计分析软件进行多元回归分析,所得的主要分析结果见图7～图9。Y=96.2633-0.1725X1-0.8300X2-1.0450X3-2.1454X12-2.6075X1X2-1.4575X1X3-2.9054X22-5.3975X2X3-3.3704X32根据SAS软件输出结果可知,响应面图形是响应值对各因素(X1、X2、X3)所构成三维空间的曲面图,根据上述回归方程作出响应面分析图(图7～图9)。每个响应面分别代表着3个独立变量之间的相互作用,此时第3个变量保持在最佳水平。由图7～图9可看出,PEG600的质量对茶总黄酮得率的影响最为显著,表现为曲线较陡;而Na2SO4质量分数和MgCl2添加量次之,表现为曲线较为平滑。模型回归方程方差分析如表3,Pr>F为0.0077,R2为0.9535,回归显著。所得提取总黄酮最佳工艺条件为:Na2SO4质量分数为15.0909%,PEG600的质量为5.9870g,MgCl2添加量为2.8515%,此时总黄酮提取率为96.3448%,并结合单因素试验,pH值为5,温度为30℃。但考虑到实际操作的可行性,将上述优化得到最佳工艺条件修正为:pH值为5,温度为30℃,Na2SO4质量分数为15%,PEG600的质量为6g,MgCl2添加量为2.9%。2.2.3次回归模型应用为检验响应面法的可靠性,试验采用上述最优提取条件进行超声波辅助提取总黄酮试验,所得试验结果为(96.31±0.85)%,实测值与理论预测值极为接近,相对偏差为0.9%,说明二次回归模型适合本试验,能够描述整个试验中各变量与响应值之间的关系,得到的提取条件参数准确可靠,具有使用价值。2.3黄酮的抗逆性2.3.1还原能力的测定以BHT和Vc为对照测定了茶叶总黄酮提取物的总还原力(见图10),总还原能力随茶叶总黄酮提取物浓度的增加而升高。在80μg/mL以内,总黄酮提取物在700nm处的吸光度与BHT和Vc差别不大,可见茶叶总黄酮提取物具有极强的还原能力。物质的还原能力是确定其潜在抗氧化活性的重要指标,还原能力大的样品是良好的电子供体可以通过提供电子使自由基变为稳定的物质,中止自由基的链式反应,同时,可与过氧化物的前体物质作用而阻止过氧化物的产生,起到抗氧化的作用,结果表明,茶叶黄酮具有一定的还原能力,可潜在用于抗氧化剂的研发。3两相分离分离双水相萃取法,由2种水溶性高分子化合物与1种盐类在水中所形成的互不相溶的两相体系,由于被分离物在两相中分配不同,便可实现分离。由于双水相萃取技术在微生物、有机化合物等的分离和纯化、预浓集过程中表现出相当好的性能,并有望用于大规模提取和纯化生物活性物质,因此越来越受到人们的关注和重视。2.3.2绿茶总黄酮提取的响应面试验茶叶黄酮对DPPH清除效果如图11所示,在试验浓度范围,不同浓度的茶叶黄酮对DPPH清除率随浓度的提高而增大,当浓度较高时,如80μg/mL趋于平缓,比Vc的清除能力稍低,比BHT稍高,可见茶叶黄酮具有较强的清除羟自由基的能力,其机制可能是由于其主要成分被羟基降解的缘故。本试验引入聚乙二醇/盐双水相体系结合超声波萃取茶叶中的黄酮,不同分子量的PEG和不同盐不同盐浓度进行试验,以PEG600/Na2SO4组成的双水相萃取率为好。将Box-Behnken设计与响应面分析法相结合,快速、有效地从影响绿茶总黄酮得率的因素中筛选出主要的影响因素,避免了非主要因素可能造成的浪费时间和资源的缺陷,并且利用响应面分析法实现条件优化,优化得到的预测结果与实验结果较吻合。茶叶黄酮提取率工艺参数的回归方程为:先称取芦丁标准品0.0138g,用50%乙醇,溶解,容量瓶定容至100mL,用50%乙醇稀释至刻度,摇匀,得到质量浓度为0.138mg/mL的芦丁标准液。吸取配制好的芦丁标准液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL分别加入0.1mol/L的氯化铝6mL,pH5.5的HAc-KAc缓冲溶液5mL,50%乙醇定容至50mL,摇匀,放置30min。以50%乙醇为参比,用紫外分光光度计于波长273nm处测其吸光度。以芦丁标准液质量浓度X(mg/mL)为横坐标,吸光度值Y为纵坐标,拟合的关系式如下:Y=31.379X+0.0175(R2=0.9936)。对试验数据进行多项式拟合回归,以提取率Y为因变量,Na2SO4质量分数为X1、PEG600的质量为X2、MgCl2添加量为X3为自变量建立回归方程如下:Box-Behnken中心组合方法是针对因子数较多,且未确定众因子相对于响应变量的显著性而采用的试验设计方法,对显著影响的因子可以确定出来,从而达到筛选的目的,避免在后期的优化试验中由于因子数太多或部分因子不显著而浪费试验资源。响应面分析法是一种优化多变量系统的有效试验工具。它是研究因素与响应值之间、因素间的交相作用,找出整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值,对实际生产更有指导意义。Y=96.2633-0.1725X1-0.8300X2-1.0450X3-2.1454X12-2.6075X1X2-1.4575X1X3-2.9054X22-5.3975X2X3-3.3704X32。方差分析结果表明拟合检验极显著,决定系数R2达0.9535,该方程能较好的预测茶叶黄酮提取率随各参数变化的规律。优化后绿茶总黄酮提取最佳条件为:pH值为5,温度为30℃,5mL的15%Na2SO4,PEG600的质量为6g,MgCl2添加量为2.9%,此工艺条件下的茶叶黄酮提取率为96.31%;采用铁还原能力法和DPPH法对茶叶黄酮的抗氧化活性进行体外评价,总还原能力随茶叶总黄酮提取物浓度的增加而升高。在80μg/mL以内,总黄酮吸光度与BHT和Vc差别不大,具有极强的还原能力。不同浓度的茶叶黄酮对DPPH清除率随浓度的提高而增大,当浓度达80μg/mL时,茶叶黄酮对DPPH清除率与BHT和Vc相当,可见茶叶黄酮具有较强的清除羟自由基的能力。由图1可看出,PEG分子量越低,其亲水性愈强,对憎水性的茶叶黄酮而言,不易分配于富含PEG的相,则K值愈小;试验中PEG400的黄酮得率为45.8%低于50%,得率反而比一般溶剂低,可能是由于PEG分子量较小,空间位阻较小;随着PEG分子量的增大,其空间阻力相应增大,疏水性增大,根据相似相溶原理,更多的茶叶黄酮分配在上相;但PEG分子量过大,系统粘度过大,影响传质,K值反而会下降;茶叶黄酮在PEG600与15%Na2SO4形成的双水相体系中得率最高,因此选择分子量较小的PEG600更为合适。取5mL质量分数15%的Na2SO4和不同质量的PEG600分别组成双水相体系作为研究体系,在pH为9,温度为30℃的条件下,考察茶叶中黄酮的分配情况,结果见图2。由图2可知,PEG600的质量低于3g时,不形成双水相,而当其质量高于3g时,则成相明显。但随着PEG600质量的增大,系统远离临界点,两相差别增大,易于形成两相,空间位阻增加,富含PEG600相的疏水性增加,使疏水性较强的茶叶黄酮类化合物趋向于含PEG600较多的上相,则K值增大;但PEG600质量过大,系统粘度增大,影响传质,则K值下降。因此选择质量为6g(即6%)的PEG600最为合适。选择4种不同盐(硫酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫酸铵)及其5mL5种不同质量浓度(5%、10%、15%、