酵母gal4上转录活化因子的调控

酵母gal4上转录活化因子的调控

本超杂交系统是研究蛋白质相互作用的生物方法。该系统于1989年提出。作为一种标准有效的蛋白质分析工具，它已成为一个完整的分析蛋白质和养分的工具，在最初的双重母性中不断得到改进，为探讨蛋白质、养分和养分酸之间的相互作用提供了另一种选择方法。1.发酵系统及分子活性的缺失真核生物中有一种特殊的上游激活顺序(upstreamactivatingsequenceUAS),可以在转录水平调控基因表达。它与激活蛋白结合大大增加启动子的转录速度。GAL4蛋白上酵母的转录活化因子,有两个结构域,即氨基端的DNA结合结构域(DNAbindingdomain,BD)以及羧基端的转录激活结构域(transcriptionalactivatingdomain,AD)。GAL4蛋白的这两个结合域将它们分开时仍分别具有转录功能,但只有将这两部分通过适当的途径连在一起后才能恢复激活转录的活性。根据这一特性,Fields等设计了一个系统即构建两个重组质粒,分别可以表达GAL4蛋白氨基端的1~147个氨基酸(BD)和羧基端的768~881个氨基酸(AD)。如果在BD上再接上一个蛋白X,又称诱饵(bait),在AD上接上一个蛋白Y,又称猎物(prey),再将这两个质粒导入酵母菌中,这样,如果X、Y蛋白在酵母核内发生交互作用,则相当于将GAL4的BD和AD又连在一起,可以激活质粒下游报道基因的表达。传统的酵母双杂交系统具有一定的局限性。假阳性就是它的一个重要问题,由于某些蛋白质本身具有激活转录功能或在酵母内表达时的转录激活作用,使X-BD融合基因与Y-AD融合基因表达产物无需特异结合,就能启动转录系统。另外有些蛋白质表面有对其他蛋白质的低亲和力区,容易形成蛋白体复合物,能够引起报告基因表达,使酵母出现相应表型,产生假阳性结果。另外,双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内,而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等,这些反应在细胞核内无法进行。还有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其它非酵母蛋白的辅助,这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。此外,外源蛋白过表达对酵母造成的毒性,以及蛋白质错误折叠造成的功能丧失也是传统酵母双杂交系统中不容忽视的问题。2.母乳喂养系统的发展2.1“诱变”系统酵母双杂交的二元诱饵系统是在单个酵母细胞中引入两个不同的BD来源的“诱饵”和一个共同AD的“猎物”,如果“诱饵”与“猎物”之间相互作用,则可激活“诱饵”特异性报告基因的表达。该系统的特点是仅在一个酵母细胞中就能同时进行两次独立、瞬时的筛选,判断一个“猎物”与两个不同“诱饵”之间是否发生相互作用并进一步比较其结合能力的差异,因而有效的提高筛选效率及灵敏度。该系统可以进行靶蛋白突变位点的研究,也可以方便的比较靶蛋白与同一蛋白家族中不同成员之间相互作用的特异性。2.2双杂交对酵母的调节作用逆向双杂交系统与传统双杂交系统的主要区别在于构建一种反向筛选的报告基因,当DNA的BD和AD的融合蛋白相互作用时,就引起报道基因表达,产生有毒性的报道蛋白,细胞不能生长。而BD-X/AD-Y作用的解离赋予酵母一种选择生长优势。因此,利用逆向双杂交系统对文库进行预清除,可大大减轻以后的假阳性鉴定工作。其最大的应用前景是将它和组合化学一道进行大规模、高通量小分子化合物或多肽药物筛选。而且许多疾病与蛋白质异常的相互作用相关,发现具有促进解离的物质对疾病的治疗是非常有意义的。2.3sos招授法检测细胞的生长和代谢SOS招募系统最早是Aronheim等在1997年应用的。Sos蛋白是人类的Ras通路中鸟苷酸交换因子(GEF),酵母中的GEF是Cdc25蛋白,与人类的Sos蛋白同源,其突变型Cdc25-2为温度敏感型,在37℃不能生长。根据这个原理建立了Sos恢复系统:将待研究的诱饵蛋白(X)的基因与Sos基因片段融合,将待筛选的cDNA文库片段与膜定位信号肉豆蔻酰基的基因片段融合,分别克隆到表达载体上,共转化酵母温度敏感缺陷株Cdc25-2。如果诱饵蛋白(X)可以与cDNA文库的表达产物即猎物蛋白(Y)发生相互作用,就可以把Sos富集到细胞膜上,使得酵母细胞可以在限制温度37℃生长;如果X不与Y发生相互作用,则Sos游离在细胞质中,酵母细胞无法在37℃生长。SOS招募系统的主要优点在于被研究的蛋白质相互作用发生在细胞质而不是细胞核中,因此在转录因子及胞质中行使生理功能的蛋白质的研究中可以得到广泛的应用。另外,一些原本对酵母生长有害的蛋白质与Sos融合并在细胞质中表达以后对酵母生长的毒性可能会降低。2.4采用rna聚合酶为基础的双杂交系统传统的酵母双杂交系统是以转录因子Gal4为基础的,依靠招募RNA聚合酶Ⅱ激活转录,有些转录激活蛋白不能用此系统分析。因此,1997年由Marsoliter等人发展了以RNA聚合酶Ⅲ为基础的双杂交系统,激活聚合酶Ⅱ的组件并不能激活聚合酶Ⅲ起始的转录,它有更低的假阳性率。在此系统中,聚合酶Ⅲ反应的报道基因SNR6的启动子被修饰,其中包含一个Gal4结合位点,有利于Gal4融合的诱饵蛋白(X)结合于SNR6启动子。猎物蛋白(Y)与TFⅢC因子的τ138亚单位融合。Gal4融合的诱饵蛋白(X)和τ138亚单位融合的猎物蛋白(Y)相互作用导致聚合酶Ⅲ反应的SNR6报道基因的转录。2.5ad-y特征分析酵母单杂交系统与双杂交系统不同之处在于,转录激活域AD相融合的猎物蛋白(Y)直接与DNA结合位点相结合,从而AD直接激活启动子下游报告基因的表达,无需BD-X的参与。因而通过对AD-Y文库的筛选可分离出与靶DNA序列直接作用的蛋白质Y。该系统为转录因子的分离鉴定提供了有效的实验手段。2.6蛋白x、y相互作用两个蛋白之间通过第三者发生相互作用,第三物可以是蛋白质、小分子或RNA。依赖于蛋白质的三杂交系统有三种情况(1)两个蛋白质X和Y之间的接触由于第三蛋白Z而稳定和加强。(2)蛋白X和Y不直接接触,而是通过另一蛋白Z相互作用,Z称作桥蛋白。(3)第三种蛋白Z的表达使蛋白X、Y之间的相互作用更易于发生。通过小分子相互作用的三杂交系统,小分子与其受体的相互作用不仅是许多生物学过程的基础,而且在医学领域有重要的价值。通过RNA的三杂交系统确定识别目的RNA的蛋白质的RNA结合域,也可以研究被已知蛋白质识别的RNA序列,利用这个系统成功地发现了许多RNA与蛋白质之间的相互作用,而RNA与蛋白质的相互作用又是某些生命的基础,如转录、mRNA的剪切及RNA病毒与宿主之间的作用等。3.双杂交分析中的假阴性现象随着酵母双杂交系统的不断改进,它的应用领域也愈加广泛,不仅用于检测蛋白一蛋白的相互作用,还可以确定蛋白质相互作用的结构域或重要活性位点、寻找与靶蛋白相互作用的新蛋白、寻找调控蛋白相互作用的化合物、蛋白质相互作用图谱的绘制以及研究疾病的发生机制和药物开发等方面。但是,双杂交系统仍然存在有一些问题,如筛选到的有相互作用的两个蛋白可能在体内是表达在不同细胞,或是出现在细胞生长的不同周期,在细胞内根本不能碰到,从而不可能发生相互作用。可能cDNA编码的某个蛋白的一部分能和目标蛋白起相互作用,而完整的蛋白则无法和目标蛋白结合。筛到的蛋白和目标蛋白的相互作用