病毒受体的研究进展

病毒受体的研究进展

病毒受体的研究一直是病毒研究的热点。病毒受体是病毒入侵靶细胞的门户,能特异性的与病毒结合,介导病毒入侵,是关系到病毒宿主范围的一个决定性因素。随着研究手段的进步,近年来有关病毒受体的研究已有较大进展,部分病毒受体的结构和功能已在不同程度上得到确认。绝大多数受体的本质是蛋白,所以研究蛋白相互作用的方法都可用来研究受体。鉴定受体的研究方法总体上从蛋白和基因两个途径入手。较早用于研究蛋白质-蛋白质相互作用的方法是偶联、免疫共沉淀等生物化学方法及病毒蛋白铺覆技术(Virusoverlayproteinblotassay,VOPBA)等。近年来开始采用一些以DNA重组克隆为基础的分子生物学方法,如噬菌体展示、酵母双杂交系统等。每一种方法各有所长,有时需要联合应用,相互印证结果的可靠性。WSSV(对虾白斑综合症病毒)是近年来对虾暴发性流行病的主要病原,如果我们掌握了其受体的结构、功能,就可以更好的了解病毒的传染机制、致病机理。预防与治疗的思路之一,就是从切断传播途径入手,合成类似受体的、可与病毒结合的阻断剂、抗体等新型药物,来控制病害的蔓延与传播;另外就是根据其受体基因结合遗传育种技术筛选、培育抗病个体。目前相关WSSV受体的研究报道还较少,本文旨在通过对可用于病毒受体鉴定的方法进行介绍和总结,为对虾病毒受体的筛选鉴定提供参考。1病毒与受体的结合病毒铺覆蛋白印迹技术是较早用与病毒受体鉴定的方法。它是在Western印迹技术的基础上,利用病毒与受体特异性结合的特点,对病毒受体进行鉴定的方法。它的基本操作步骤是,利用清洁剂裂解细胞膜然后做SDS电泳,转印于硝酸纤维素膜,与病毒结合,最后洗去未结合病毒。病毒与受体结合的显示方法有两种:一是直接利用同位素标记的病毒粒子;二是用单克隆抗体或多抗与病毒结合。使用多抗要避免与寄主蛋白发生交叉反应,如有交叉反应,可通过寄主蛋白预吸收封闭与多抗结合的寄主蛋白来消除。使用本方法的前提是受体活性是由单一多肽决定而不需要膜的其它组份,而且经过裂解液的处理不会丧失活性。如是碳水化合物型受体,就可用薄层层析来分离糖脂,然后检测与病毒的结合情况。用此方法进行受体研究的病毒有:登革热病毒、斜纹夜蛾多角体包埋型病毒、牛病毒性腹泻病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒、麻疹病毒、狂犬病病毒、伪狂犬病毒、猪流行性腹泻等。2噬菌体的分子检测噬菌体展示的基本原理就是将外源基因插入到噬菌体衣壳蛋白基因中使之与衣壳蛋白融合表达,随着噬菌体的成熟装配,融合蛋白展示于噬菌体表面并能保持较好的空间构型。到目前为止,利用此方法已陆续建立了噬菌体随机肽库、抗体库、cDNA展示文库等技术,并广泛用于配体-受体关系的研究中。以丝状噬菌体为例,丝状噬菌体属于单链DNA病毒,其DNA在细菌内滚环复制,细菌不被裂解,但生长速度减慢,而且可分泌出大量成熟的噬菌体颗粒(每代约100个)。较早发展的是f1,fd和M系列丝状噬菌体载体,它们的单链DNA长约7000bp,一级结构极为相似(99%同源性)。其编码的主要衣壳蛋白为pⅧ,其次为pⅢ,pⅥ,pⅦ和pⅣ。展示区利用的是pⅢ和pⅧ的N端,因为此端是游离的。要表达的序列插入其末端以融合蛋白的形式表达。利用噬菌体筛选目的蛋白基于3个基本事实①插入外源基因并表达在噬菌体颗粒表面,不影响噬菌体的生活周期,同时其外源蛋白天然构象也能被相应的抗体或受体所识别②利用连接于固相支持物(玻璃珠、酶标板等)的靶分子(或统称筛选剂或受体),可以采用适当的Panning方法(亲和、洗脱、扩增、亲和的循环步骤)洗去非特异结合的噬菌体,最终筛选出能结合靶分子的目的噬菌体(或统称配体)③外源蛋白或多肽表达在噬菌体表面,其编码基因与噬菌体DNA是偶联的,通过分泌型噬菌体的单链DNA测序推导出来,这是其它一些技术做不到的,此技术的优势是可在体外完成对外源多肽或蛋白的研究并方便的获得目的DNA序列。这类单链噬菌体是测序和突变分析的理想材料,不足是培养期长、不稳定、表达的肽链较短。近年来发展的λ噬菌体、T7噬菌体等裂解性噬菌体载体生长快,稳定性强,可表达较长序列,并且其构象更接近于天然情况,适合用来构建cDNA展示文库,董倩等利用T7cDNA噬菌体展示方法筛选了乙型肝炎病毒前S1蛋白的结合蛋白。由于原核表达系统没有对真核基因内含子的剪接功能,所以噬菌体展示系统只能表达原核生物基因、不需要内含子及外显子拼接的DNA病毒,或是由真核生物或RNA病毒等的mRNA反转录的cDNA。3酵母双杂交系统论yeastwell随着分子生物学技术的发展,近年来开发了一些研究蛋白之间相互作用的更简便有效的方法。其中之一是由Fields和Song创立的酵母双杂交系统(YeastTwo-HybridSystems),与传统方法相比,它最突出的特点是可以在酵母这种生长迅速且易操作的体系内部研究蛋白质之间的相互作用,避开了传统的体外方法中实验条件对蛋白质研究的不利影响,且无需体外纯化蛋白、一次操作可分析大量基因编码区,灵敏度高,而且通过筛选基因组文库或cDNA文库可以直接找到与诱饵蛋白相互作用蛋白的DNA序列。3.1转录激活蛋白的激活和恢复双杂交系统的产生基于对酵母转录因子Gal4蛋白的认识。天然Gal4分子是Gal1基因转录必需的蛋白质因子,它由一条多肽链组成,含881个氨基酸。它有两个相对独立的结构域:DNA结合域(DNA-BindingDomain,DNA-BD),由位于N-末端的147个氨基酸组成,功能是识别并结合位于Gal1基因的上游激活序列(UpstreamActivatingSequence,UAS);另一个是转录激活域(ActivatingDomain,AD),由位于C-末端的768~881个氨基酸构成,负责RNA聚合酶复合体激活转录的功能。DNA-BD和AD对激活转录是必不可少的,二者之一单独作用不能激活转录反应。研究表明,当这两个功能域位于不同肽链上,只要它们在空间上充分接近,即使是非共价结合也能够恢复Gal4作为转录因子的活性。基于上述事实,可以借助两个能相互作用的蛋白质为纽带,将相互分开的DNA-BD和AD在空间上拉近,构建一个融合的、具有功能的转录激活蛋白。一般是将已知蛋白(常称为诱饵蛋白,baitprotein或X蛋白)的基因与编码DNA-BD的序列融合并在酵母中共表达产生融合蛋白Gal4-BD-Bait,同时将编码未知蛋白(常称为prey或Y蛋白)的基因与编码AD的序列融合并在酵母中共表达产生另一融合蛋白Gal4-AD-prey,将以上两个酵母株融合,如果两个外源蛋白有结合活性,那么借助Bait和prey的连接使得Gal4-BD和Gal4-AD空间上靠近,恢复其转录激活蛋白的活性,并激活报告基因。也可以将两个分别构建的质粒载体共转化一个酵母株。目前有很多生物公司以试剂盒的形式提供酵母双杂交系统。本系统的核心组成就是两种分别用于构建bait和prey融合蛋白的质粒及相应宿主酵母株。宿主酵母已经过改造,除去了Gal4基因活性,并重组入新的报告基因。报告基因有显色型的如LacZ、MEL,营养选择标记基因一般为Leu、His、Ade等,为了增加阳性克隆的可信度,一般同时构建几个报告基因,不同报告基因之间是并联关系,互不影响,可联用,也可选用。不同的报告基因对转录激活蛋白的敏感度是不同的,而且有些报告基因有基底水平的表达,遇到这种情况可用一些表达产物的抑制剂减少背景。还有一种情况是,有些bait蛋白本身就有转录因子活性,这时就需要对其DNA序列进行改造,酸性的两亲性结构域倾向于有转录活性,不过改造也有可能除去诱饵蛋白的结合功能,需慎重。近年来,酵母双杂交系统在蛋白质相互作用的研究中得到广泛应用,李凌云等利用本系统筛选出了麻疹病毒的绒猴细胞受体基因。本实验室正在用酵母双杂交系统筛选WSSV受体基因,我们以较易为WSSV感染的中国对虾鳃组织为材料提取总RNA构建一个cDNA文库,以WSSV的粘附蛋白(vriusattchmentprotion)VP39为诱饵构建融合质粒,将含诱饵质粒的菌株与cDNA文库融合并利用选择性培养基筛选,最后分析阳性克隆。3.2母乳喂养系统的发展3.3.1杂交系统在研究细胞信号传递的过程中常涉及到第三个分子的作用,于是发展了三杂交系统。它的原理是,除利用了传统的双杂交系统中的两个融合蛋白AD-prey和BD-bait外,还必须借助第三个分子的参与实现相互作用,第三个分子可以是蛋白质、多肽、小分子配体、RNA等。3.3.2单混合系统单杂交系统用于检测蛋白与DNA序列的相互作用,不再赘述。3.3.3双向双杂交和反向单杂交负选择系统也叫反向选择系统,与正向选择系统的区别在于其报告基因的诱导机制或表达结果不同:一种是当报告基因被BD-X/AD-Y激活时,表达产物直接或间接对宿主细胞有毒;另一种方式是在正向报告基因上游再引入一个含阻遏子的操纵元,当BD-X/AD-Y有相互作用时则激活阻遏蛋白的转录,阻遏蛋白就会抑制报告基因的表达。反向双杂交系统用于筛选蛋白突变体和确定能够打破特异蛋白相互作用的试剂。反向单杂交系统用于分析DNA结合蛋白的突变或特异DNA序列突变对二者相互作用的影响。反向三杂交系统可用来研究两个已知蛋白相互作用的解离剂。3.3.4酵母双杂交的基因表达传统的酵母双杂交系统是由RNA聚合酶Ⅱ来转录报告基因,而建立在RNA聚合酶Ⅱ激活转录基础上的酵母双杂交系统的不足是不能研究与激活因子或辅助激活因子的相互作用蛋白,因它本身就可激活报告基因的表达,这也可能是酵母双杂交系统存在假阳性的原因之一。RNA聚合酶Ⅲ主要用来转录tRNA。在酵母菌株中通过改造,用RNA聚合酶Ⅲ替换RNA聚合酶Ⅱ,就可避免由于bait蛋白具有激活RNA聚合酶Ⅱ而导致报告基因表达的情况。3.3.5微生物及其产物酵母双杂交系统的缺陷是不能研究高等生物中常见的需翻译后加工的蛋白质之间的相互作用,如磷酸化、甲基化、糖基化、二硫化等。VidalM建立的哺乳动物双杂交系统用氯霉素乙酰转移酶为报告基因。其活性可在细胞提取物中检测。该方法主要用于检验已知蛋白的相互作用。3.3.6酵母膜的信质元素以上介绍的几种酵母双杂交系统,其蛋白的相互作用是发生在核内的,但有些全长的跨膜蛋白要么不能有效的转运到细胞核中,或转运进去后,由于不能正确折叠或稳定性差,使蛋白相互作用很弱或不能发生。因此对于研究膜蛋白含膜受体、分泌蛋白及胞质蛋白等就有很大局限性。AronheimA等建立了应用SOS招募系统(SOSRecruitmentsystem,SRS)。在SOS招募系统中,蛋白质的相互作用被人为限制在酵母细胞膜上,该系统利用真核生物中普遍存在的ras信号传导途径作为蛋白质相互作用的选择标记。Ras是一个膜偶联信号蛋白。在本系统中,利用酵母的温度敏感株、在36°C不能生长的Ras途径突变体作为宿主,将人的SOS蛋白与Bait蛋白融合,Prey蛋白通过与豆蔻酰化信号蛋白融合定位于膜上。若Bait与Prey能结合,则SOS蛋白就会被招募在细胞膜上并激活Ras蛋白,产生Ras途径,使突变株在36℃可以生长。4蛋白质功能及相互作用蛋白质芯片是在后基因组时代为阐明基因组计划中测定的许多不明功能序列的基因的作用而发展的新技术,与研究蛋白质的传统生化技术相比,其优点是高通量,微型化。蛋白质芯片可以点阵排列的方式在很小的片基上有序的集成多种蛋白质活性分子(配基),利用微量生理或生物采样,可以同时检测和研究不同蛋白质的功能及蛋白质之间的相互作用。蛋白质芯片是一种用于蛋白质组水平研究的理想方法。目前已开发的蛋白质芯片技术,一种是建立在椭偏成像原理基础上的光学生物分子分析技术,通过在芯片表面上由蛋白之间的相互作用引起的蛋白薄层厚度的变化,利用椭偏分析与快速电子摄像技术显示蛋白分子之间的相互作用,具高空间分辨率、快速取样和操作简单的特点。由此又衍生了活性探针及光学多元蛋白芯片技术。另一种是用载玻片制作的荧光标记蛋白质芯片,此芯片的技术的优点是易于实现,用标准的实验室设备就能做到。同DNA分子相比,蛋白质分子的空间结构复杂,其生物活性与空间结构密切相关;蛋白质不能被简单的扩增或原位合成,难以利用拷贝增加的方式来提高检测的灵敏度;其次,蛋白质的相互作用无序列可循,而是类似于抗原-抗体的特异结合作用;另外,在操作过程中,蛋白质很容易变性。因此,蛋白质芯片技术在具有巨大的发展潜力的同时,它的开发难度也是很大的。5yfp和cfp的相互作用荧光共振能量转移技术利用了绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)及其突变体做为融合标记物来指示蛋白之间的相互作用,当两个荧光发色基团在足够靠近时,供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态,在该电子回到基态前,通过偶极子相互作用,实现了能量向邻近的受体分子转移(即发生能量共振转移)。以GFP的两个突变体蓝绿色荧光蛋白(cyanfluorescentprotein,CFP)、黄色荧光蛋白(yellowfluorescentprotein,YFP)为例简要说明其原理:CFP的发射光谱与YFP的吸收光谱有相当的重叠,当它们足够接近时,用CFP的吸收波长激发,CFP的发色基团将会把能量高效率地共振转移至YFP的发色基团上,所以CFP的发射荧光将减弱或消失,主要发射将是YFP的荧光。两个发色基团之间的能量转换效率与它们之间的空间距离的6次方成反比,对空间位置的改变非常灵敏。例如要研究两种蛋白质a和b间的相互