槐米中芦丁提取与纯化工艺研究

槐米中芦丁提取与纯化工艺研究

蝗虫是指豆科植物蝗虫。槐米含有芦丁达20%以上,是芦丁的主要原料来源。芦丁是一种黄酮类化合物,为结晶粉末或无晶形粉末,有苦味,略溶于水,能溶于热水与乙醇。目前已报道多种芦丁纯化方法主要为大孔树脂法,活性炭吸附法等。工艺繁杂,纯化时间长,损失量大。现采用冷水结晶的方法来提高槐米提取纯化物的芦丁含量。纯化效果明显,操作简单可行。1仪器和试剂盒1.1梅特勒托利多分析天平公司HP1200高效液相色谱仪及化学工作站(美国Agilent公司);梅特勒托利多分析天平(瑞士梅特勒托利多有限公司);低速大容量多管离心机(LXJ-Ⅱ,上海医用分析仪器厂)。1.2测试剂槐米(广东康美药材饮片总公司);95%乙醇(分析纯,天津大茂有限公司);芦丁对照品;甲醇为色谱纯;水为重蒸水。2方法和结果2.1无醇味提取液制备每次称取槐米20g,按照因素水平表(见表1)和正交试验表(见表2)进行试验,提取完成后浓缩至无醇味,用蒸馏水定容至400mL。放置冰箱静置过夜,重分析出结晶后,第二天将提取液离心15min,弃去上清液,下层沉淀真空干燥,称重,检测。离心参数为3000r·min-1,真空干燥参数为真空度0.08Mpa,温度75℃,时间12h。2.2纯度方法每次称取提取后结晶粉末20g,用20倍室温蒸馏水搅拌混匀、静置、离心、留样、真空干燥、称重、检测。2.3综合评分法确定芦丁含量配比,结晶粉末重量为1010.以芦丁含量与结晶粉末得率作为评价指标,采用加权评分法进行评分,考虑到芦丁含量较为重要,其权重系数取0.8,结晶粉末得率取0.2,综合评分=(芦丁含量百分比/最大芦丁含量百分比)×100×0.8+(结晶粉末重量/最大结晶粉末重量)×100×0.2。芦丁含量=芦丁重量/结晶粉末重量。2.4重量测定2.4.1流动相柱温度色谱柱:AgilentXDBC18柱(4.6mm*150mm,5μm);流动相:甲醇:1%冰醋酸(43∶57);柱温30℃;流速0.8mL·min-1。在该色谱条件下,芦丁保留时间为9.43min(见图2)。2.4.2对照溶液的制备精密称取芦丁对照品6mg,用95%乙醇溶解定容至50mL,备用。2.4.3样品溶液的制备精密称取结晶粉末0.01g,用95%乙醇溶解定容至50mL,摇匀,用0.45μm有机系微孔滤膜过滤,即得样品溶液。每次进样2μL。2.4.4对照品浓度测定分别精密吸取对照品溶液1μL、2μL、3μL、4μL、5μL按照色谱条件进行测定,得标准曲线方程为面积Area=1.03379664*Amt-0.9726802(见图1)。Amt为对照品浓度(ng·μL-1)。相关系数为0.99999,表明此芦丁对照品在1μL～5μL之间峰面积与含量的线性关系非常好。2.4.5样品含量测定在上述色谱条件下,每次精密吸取2μL进行测定。按照外标法计算芦丁含量百分比。2.5实验结果与最佳提取工艺确定(见表2)。由正交试验结果(表2)可知,槐米中芦丁提取工艺的影响因素为D>B>A>C。方差分析结果(见表3)可知因素B(溶剂倍数)与因素D(提取次数)对芦丁含量与结晶粉末重量有非常显著影响,因素A(乙醇浓度)对芦丁含量与结晶粉末重量有显著影响,因素C(提取时间)对芦丁含量与结晶粉末重量无显著性影响。最后确定最佳提取工艺为A3B2C1D3。按照最佳提取工艺进行3批验证试验。由验证试验结果(见表4)可知,该工艺条件下提取槐米,芦丁含量及结晶粉末重量均达到较高水平,工艺稳定。2.6芦丁的纯化结果每次称取20g上述提取物真空干燥得粉末进行纯化实验。每次纯化时先加入20倍室温水,充分搅拌、混匀,冰箱冷藏(0～5℃)静置5h后,离心,弃去上清液,如此反复操作。完成纯化工作后,取离心后沉淀真空干燥,进行上述HPLC芦丁含量测定。由纯化结果(见表5)可知,当纯化至第3次后,芦丁含量已达到89.82%,再进行第三、第四次纯化,芦丁没有明显变化,而且随着后两次的纯化进行,结晶粉末却不断损失。因此,可以得知,进行3次纯化即可达到89%的纯度。由图2、图3可知,槐米的提纯物杂质峰少,芦丁含量较高。3芦丁最佳纯化工艺通过正交实验确定槐米中芦丁最佳提取工艺为:70%乙醇浓度,15倍提取槐米3次,每次1h。提取物最佳纯化工艺为:提取液浓缩至无醇味静置形成结晶后,离心,20倍水洗涤3次,芦丁纯度可达89.