纳豆激酶分离纯化的双水相工艺研究

纳豆激酶分离纯化的双水相工艺研究

1金属螯合双水相邻和分配技术imap纳豆激酶（nk）是纳豆糖酶（ba细胞沙脂菌）产生的一种丝绸氨酸酶。具有诱导纤溶活性和溶胀性，可治疗和预防血栓形成疾病。还可以刺激内皮细胞产生的tpa，以提高溶胀能力。纳豆激酶来源广泛、价廉易得,溶栓活性高、特异性强,是一种很有前途的新一代抗栓药物。常规的分离流程为:发酵液离心,硫酸铵分级沉淀后进行SephadexG-75凝胶层析,NK回收率74.3%,纯化倍数4.75。还有用扩张床吸附层析来进行NK的初步纯化,具有较好的效果。金属螯合双水相亲和分配技术(IMAP)把金属螯合亲和作用引入双水相分配,具有选择性好、分离条件温和、与生物质兼容性好等优点而倍受关注。对于表面具有His-X3-His、His-Gly-His等位点的天然蛋白质或带有组氨酸标签的基因工程蛋白具有高度的亲和作用。纳豆激酶是由275个氨基酸残基组成的单链多肽,氨基酸一级序列结构中存在-H(64)GTH(67)-结构,可以考虑应用IMAP技术进行分离。本文拟采用IMAP技术对纳豆激酶进行粗分离,通过对聚合物的分子量、浓度、亲和配基加入量、溶液的pH值、相比以及生物质加入量等因素的考察,优化纳豆激酶IMAP分离的工艺参数。2实验材料和方法2.1其它试剂的制备PEG-IDA-Cu(II)由本实验室制备,聚乙二醇(PEG,浙江衢化集团),羟丙基淀粉(PES,瑞典CarbamylAB公司),其它试剂均为市售分析纯。纳豆激酶产生菌为BacillussubtilisHL-1,由浙江大学生物工程研究所筛选获得,分离用发酵液由3.7L发酵罐(Bioengineering)培养得到。培养基组成为(g⋅L-1):胰蛋白胨,22.7;木糖,20;Na2HPO4,5.37;NaH2PO4,1;CaCl2,0.2;MgSO4,0.5;pH,7.0。发酵液调pH为8.0,保藏于4备用。2.2实验方法2.2.1分析纳豆激酶酶活测定采用纤维蛋白琼脂糖凝胶平板法。蛋白质浓度测定采用考马斯亮蓝法。2.2.2发酵液体系的配制双水相系统在室温下配制,系统总重5g,各组分的浓度均用质量百分比表示。将PEG、PES和无机盐配制成一定浓度的母液,按预先设计好的总组成,精确称量,配制成相应的双水相系统,加入一定量的发酵液、缓冲液补足至5g,封口,上下颠倒数次,混匀后,1000r⋅min-1离心5分钟使其分相。测定上下相体积,取样,分析上下相中NK及总蛋白含量。文中NK的分配系数Ke,蛋白质分配系数Kp,相比R分别表示上下两相间酶活、总蛋白和相体积的比值;Ye和Yp则分别为上相中纳豆激酶和总蛋白的收率,纯化因子(P.F.)为Ye和Yp的比值。2.3水相系统分配的选择性双水相萃取具有可以直接处理发酵液的优势,把金属螯合亲和作用引入双水相系统加强了分配的选择性,也给原本影响因素就比较多的双水相分配增添了研究难度。图1示意了金属螯合双水相亲和分配的过程开发,本文对图中的各影响因素进行比较系统的研究,以逐步寻求分离条件的优化。3结果和讨论3.1酶活性研究3.1.1温度对24h酶活的影响实验表明,在25∼37范围内,NK酶活相对稳定,当温度超过45时,酶活逐渐丧失,当温度超过60,则因蛋白质变性而迅速失活。在37下,24h酶活仍可保持在95%以上,结果如图2所示。本实验于室温下进行,故可忽略温度对酶活损失的影响。3.1.2不同ph值对纳豆激酶酶活的影响酶对环境pH值的敏感程度也是分离中必须考虑的一个重要因素,这里以NaOH或HCl来调节系统的pH值,分别考察pH对纳豆激酶酶活的影响。分别将含有NK的样品放置在试管内,调节pH值,其中部分样品在调到要求的pH后,马上就测定其酶活(记为0h)、而部分样品在不同pH环境中放置12h,再测各管中纳豆激酶的酶活。同时将放置12h后的样品,重新调节到纳豆激酶的适宜pH值(取7.8),再放置12h,测定酶活,结果如图3所示。图3结果表明,在pH5.0∼11.5之间,酶活都能保持在1100U·mL-1以上;但放置时间较长,如12h,当pH降至6.5以下时,酶活明显降低;但是,当pH调回7.8时,酶活能基本恢复到初始状态。3.1.3聚合物对酶活的影响考察了双水相成相聚合物PEG、PES以及亲和配基PEG-IDA-Cu(II)的存在对酶活的影响,由图4可见,成相物质的存在对酶活没有明显抑制作用,即使达到了很高的聚合物浓度(40%PEG和30%PES)酶活回收率仍在90%以上,少量聚合物的存在反而对酶活有稳定作用。亲和配基的存在,对酶活会产生较大的影响,但是在实际使用中,亲和配基的使用量很少,一般在5%以下,此时,酶活回收大于90%,即使在最大使用量10%时,酶活回收仍超过80%,所以,实验中忽略配基的加入对酶活的影响。3.2peg/na2so4系统分配机制对kePEG和若干无机盐会形成双水相系统,不同的系统中金属配基对目标物的亲和分离效果也不相同。首先,考察了NK在PEG+PEG-IDA-Cu(Ⅱ)/(NH4)2SO4系统中的分配情况,发现亲和配基的加入并不能提高NK的分配系数。进一步考察了NK在PEG/Na2SO4系统中的分配情况,结果见表1。PEG/Na2SO4系统中,较低的pH对分配有利,亲和配基的加入能显著提高Ke。但由于Kp较大,杂蛋白也倾向于上相分配,纯化因子不高。因此,PEG/无机盐系统对NK亲和分离不是十分有效。3.3纳豆激酶在双聚合物系统中的分配3.3.1peg分子量的影响考虑到PEG/无机盐系统加入亲和配基的分离效果不是十分有效,因此改用双聚合物系统。考察了PEG/PES系统中NK的分配,选择PES100(分子量100,000)作为一种成相聚合物,考察PEG分子量变化的影响,结果示于图5。随着PEG分子量的减小(从20,000到2,000),NK的分配系数(Ke)增大。比较可见,PEG2000/PES100系统的Ke较高,但杂蛋白的分配系数(Kp)也较大,影响了纯化因子。因此,为了得到较高的纯化因子,选择PEG4000/PES100系统进一步优化。图5比较了PEG/PES100双水相系统中PEG浓度对纳豆激酶分配的影响,发现PEG浓度对分配没有明显的影响。3.3.2金属螯合亲和配基的分配系数在PEG4000/PES100系统中,保持PEG总量不变(9%),然后加入不同量的PEG-IDA-Cu(II),以考察不同亲和配基浓度对分配的影响,结果见图6,其中NK发酵液加入量固定为5%。随着系统中PEG-IDA-Cu(II)加入量的增加,NK在双水相中的分配系数迅速增加,达到一个最大值后略有下降,即过多的亲和配基反而使分配系数有所下降。主要原因可能在于金属螯合亲和配基本身在双水相系统中也有一定的分配,随着分配于上相的亲和配基与目标蛋白的结合位点逐渐达到饱和,亲和效果逐渐加强,表现为分配系数的增大;当亲和配基量增加到一定程度后,下相中亲和配基积累过多,将导致NK部分向下相转移,分配系数下降,亲和效果降低。3.3.3ph对纳豆激酶活性的影响固定系统中亲和配基的含量为2%,考察了pH在5∼10之间的亲和分配情况。由图7可见:不同PEG分子量的PEG/PES系统,Ke随pH的变化十分明显,先随pH的增加而增大,至pH8∼9之间出现最大值,之后随pH增加略有下降。△LogKe=LogKea-LogKeo,Kea和Keo分别代表了亲和配基存在和无亲和配基时,纳豆激酶在上下相的分配系数,由此可以很好地表征亲和配基的引入对双水相系统提高选择性的贡献。图8比较了PEG4000/PES100系统中,无亲和配基存在(PEG9%,PES16.7%),及配基含量2%(PEG7%,PEG-IDA-Cu(II)2%,PES16.7%)时,pH对NK和总蛋白分配的影响。由图可见,亲和配基的加入明显提高了NK的分配系数,而杂蛋白随pH变化在两相间分配情况的变化不大。因此,选择合适的pH(pH8.2)能达到较好的分离效果。3.3.4配基、发酵、汁添加量的确定两相的相比也会对分配产生影响,考察了相比在0.4至4.1(上相/下相)范围内,相比对亲和分配的影响,结果见图9所示,这时,固定亲和配基的加入量为2%,发酵液加入量为5%。由图9可知,随着相比的增大,分配系数变化不大,收率明显增加,但纯化因子有所下降,因此必须综合考虑收率和纯化因子的因素。选择相比在1左右时,既能得到较高的纯化因子,又能保证90%左右的酶活收率。当相比为1.2时,系统组成为(w/w):PEG-IDA-Cu(II),2%;PEG4000,7.6%;PES100,20.2%;pH,8.2;发酵液加入量5%。3.3.5生物质加入量对纳豆激酶活性的影响为了提高分配过程的处理量,在上述研究的基础上,进一步考察了发酵液加入量对分配的影响。在PEG4000/PES100(PEG+PEG-IDA-Cu(Ⅱ)9.6%,PES20.2%)系统中,当发酵液加入量由2%增至30%,同时按比例提高亲和配基的加入量,纳豆激酶在上下相的分配情况见图10。随着生物质加入量的增加,加入量在20%的范围内亲和效果略有下降,当加入量大于20%,由于蛋白质溶解度的限制以及杂蛋白的干扰,分配系数有较明显下降。因此,合适的发酵液加入量为15%。3.3.6系统的分离结果在上述优化条件下,对纳豆激酶的双水相亲和分离进行了适当的放大试验,系统总量分别增加到50g和100g,其分离结果示于表2中。由表2的结果可见,对于亲和双水相系统,可以较好地进行线性放大。3.3.7减少杂蛋白的分配在一次萃取以后,分离出上相,加入与原下相相同组成和体积的纯下相,进行再次分配,可进一步去除杂蛋白,提高纯化因子。二次分配,Ke=16.02,Kp=0.94,Ye=89.42%,P.F.=1.69。因此,经过两次萃取,纳豆