太湖不同营养水平湖心区水体细菌群落结构研究

太湖不同营养水平湖心区水体细菌群落结构研究

1浮游动物对微生物的作用湖泊富营养化已成为世界范围内的一个突出环境问题。这导致的水质和水环境恶化的严重后果引起人们的关注，但其发生机制尚不清楚（azberietal.，2000）。在水生生态系统中，微生物是最敏感、易受环境影响的生物群体。它们不仅是水生生态系统生物量的重要组成部分，也是物质循环和养分交换的重要组成部分。微生物不仅可以将有机碳（poc）分解，还可以将溶解有机碳（doc）转化为连续的浮游植物。浮游生物通过添加沉积物和自己的组件进入上层，以控制水生生态系统的基本功能。然而，通过分离和培养方法，我们只能获得不到1%的环境微生物（azametal.，1995）。大量环境微生物在传统的分离和繁殖过程中被破坏，对环境中微生物的真实存在认识丧失。利用微生物生态学研究可以显著提高人类对实际环境中微生物多样性的认识（pace，1997）。越来越多的研究人员开始关注水生生态系统环境因素与微生物群落变化之间的联系关系（meetal.1999；lentier，2001；yannarel，2004）。太湖是一个典型的水平湖。经过长期的历史发展，不同类型的湖泊形成了生态效应强的湖泊，如草类、藻类、贫化和极端丰富的营养化。这为研究水生微生物对污染负荷提供了理想的场所。在这项工作中，我们使用了16-srdna-dgge和fdc方法来研究不同类型湖泊中浮游生物的群落变化，并将改性梯度凝胶和细菌灯直接计数与不同类型湖泊的横向变化相结合。更全面地反映了微生物多样性和生物量的动态变化，以发现水体富营养化过程对水生微生物群的影响。2材料和方法表面活性剂2.1水湖泊水质状况太湖(30°56′～31°34′N,119°554′～120°36′E)面积2338km2,最大水深2.6m,平均水深1.9m,是一典型的浅水湖泊(秦伯强等,2004).运用GPS定位系统在不同湖区布设8个采样点,1#、2#点位于五里湖区,该区紧靠无锡市,水体处于超富营养化状态;3#、4#点处于梅梁湾中,该湖湾自20世纪90年代起,每年的5到10月份均有蓝藻出现,水体富营养化严重;湖心的5#、6#点由于远离岸边,受外界干扰较小,水体的营养水平相对较低;7#、8#点所在贡湖湾是水草丰富区,分布有大量马来眼子菜及少量微齿眼子菜等沉水植物.具体点位见图1.2.2水样的预处理和分析水样的采集于2005年2月进行,采集水深0.5m左右处水样.微生物样品的采集:用于表面荧光记数的水样注入经酸浸泡、清洗干净、预先灭菌的玻璃瓶中,加入无颗粒甲醛(甲醛终浓度2%),带回实验室4℃保存直至分析;用于基因组DNA提取的水样,放入带有冰块的保温箱中运回实验室后-20℃保存至分析;其它水样用预先洗干净的塑料瓶采集,放入带有冰块的保温箱运回实验室后立即测定.2.3样品分析2.3.1浮物优度染色采用表面荧光直接计数的方法,用核酸染料DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole)染色,于荧光显微镜(ZeissMicroscope,100WHBOMercurylightsource)在放大倍数为16×100倍数下观察记数,然后将视野细菌数量转换为每毫升实际细菌细胞数(cells·mL-1),即为浮游细菌丰度.2.3.2聚碳酸酯盐悬液的制备在无菌条件下取500mL水样用定性滤纸(8μm,47mm,Millipore)过滤,除去样品中的悬浮颗粒,收集滤液,滤液通过聚碳酸酯膜(0.22μm,47mm,Millipore)真空抽滤,然后用无菌缓冲液冲洗两次.将滤膜取出剪成碎片装入1.5mL的离心管中-80℃保存.2.3.3dna提取纯度的测定将离心管在室温下解冻,在其中加入30μL新鲜的溶菌酶溶液,37℃温育1h(160r·min-1)后,加入500μLSDS(10%)溶液和10μL蛋白酶K(20mg·mL-1),接着温育2h.随后加入200μL的5mol·L-1NaCl上下颠倒混匀后在其中加入预热到65℃的100μLCTAB溶液,并在65℃下温育50min.初提的DNA中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)上下颠倒、混匀、离心(12000g,10min),取上清加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)上下颠倒、混匀、离心(12000g,30min),取上清加入0.6倍体积的异丙醇常温沉淀1h,离心(16000g,20min)后去上清液,将DNA溶于30μL无菌水,加入1.5μLRNaseA(20mg·mL-1)37℃消化20min.DNA提取液的测定,使用酶标仪(T)对提取的DNA粗提液样品进行测定(OD260/OD280),计算所得样品DNA产量和纯度.2.4扩增产物的pcr扩增使用16SrDNAV3区通用引物F341(5’CCTACGGGAGGCAGCAG3’)和R518(5’ATTACCGCGGCTGCTGG3’)从水样基因组总DNA中扩增16SrDNAV3区基因片段,PCR扩增体系和程序参考文献于热循环仪上进行反应(PTC-200MJResearch公司).为使扩增产物能在DGGE上更好的分离,一个40bp的GC夹子(CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG)加在F3415’端.PCR反应体系:10×PCRbuffer(含25mmol·L-1MgCl2)5μL,引物F341GC和R518各15pmol,dNTPs12.5pmol,约25ng的基因组DNA,Taq酶5μL,加milli-Q水至50μL.采用降落PCR方法,反应参数:94℃预变性4min;94℃变性1min,65℃退火1min,然后以每一循环降低1℃进行10个循环,72℃延伸1min,最后,以55℃退火进行23个循环;72℃延伸10min.2.5聚丙烯酰胺微生物的扩增基因组总DNA16SrDNAV3区扩增片段通过DGGE(C.B.S★SCIENTIFIC公司)分离来研究微生物群落多样性.聚丙烯酰胺的变性梯度范围为35%～55%,DNA扩增产物上样量约为200ng,150V,1×TAE缓冲液中电泳600min.电泳完毕后用SYBRgreenI(1×TAE,1∶10000)染色30min,通过UVI成像系统来成像.2.6紫外分光光度法温度现场用水温计直接测定;总氮、总磷用紫外分光光度计测定;叶绿素a用90%丙酮萃取荧光分光光度法测定,DOC用美国生产的1020A型TOC仪测定.2.7处理数据所有实验数据均在SPSSforwindows(11.5)统计软件上进行处理.3结果结果3.1水温变化不大,样品点水温随时间的变化各采样点的水深在整个太湖中变化不甚明显,最浅处水深2.30m,最深2.85m,总体上变化不大.不同湖区各采样点水温基本上变化不大,维持在4.5℃左右,但是存在从河口到大太湖略微下降的趋势,这可能与五里湖和梅梁湾紧靠无锡市有关.水体中营养物质氮、磷含量在不同湖区中存在明显差异,五里湖和梅梁湾明显高于湖心和贡湖湾,有机碳和叶绿素的含量也存在类似变化趋势.3.2浮物群落数量的比较表面荧光直接计数结果显示,水体中浮游细菌数量在不同营养水平湖区中具有明显水平分布特征(见图2).在营养水平较高的五里湖和蓝藻频繁出现的梅梁湾水体中浮游细菌数量显著高于大太湖和贡湖湾(p<0.05),其中位于营养水平较高的2#、4#采样点细菌数量分别达5.33×106cells·mL-1和5.92×106cells·mL-1,相比之下湖心区细菌数量明显较少,6#点最低,为2.68×106cells·mL-1.但是,富营养化程度较高的五里湖和梅梁湾及营养水平较低的湖心和贡湖湾中浮游细菌的数量差异并不显著(p>0.05).总体上,水体中细菌数量在太湖各个不同营养水平湖区中存在较大差异.3.3srdna片段pcr和测序为避免水体中杂质的干扰(小型原生动物,藻类及样品中的腐殖质等杂质),实验采用了不同孔径滤膜过滤富积水体中细菌生物量.利用冻融和化学裂解相结合的方法提取水体中微生物的基因组DNA.通过-80℃的超低温冷冻和温浴,以及溶菌酶和表面活性剂等手段尽可能使全部菌体破壁,使DNA最大限度地释放出来,保证获得全部细菌基因组DNA,并增加DNA的提取效率.提取的DNA通过1.2%的琼脂糖凝胶电泳检验,样品总基因组片段均在23kb左右,DNA测定结果OD260/OD280在0.16～0.21范围内,达到PCR扩增所需要求.将提取出的DNA进行16SrDNA片段的PCR扩增.采用降落PCR扩增方法,提高了样品的扩增特异性,降低了DGGE分析的误差.经PCR反应后获得了各采样点微生物的16SrDNA基因V3区的目的片断,用0.5%的琼脂糖凝胶电泳检验,扩增出的DNA片段大小为230bp左右(碱基对),证实为16SrDNAV3区特异性片段.各样品扩增产物可用于DGGE分析.3.4凝胶电泳dage指纹图谱的建立变性梯度凝胶电泳(DGGE)变性梯度凝胶电泳可对具有相同大小分子量而不同DNA序列的片断进行分离,由此推断不同环境样品PCR产物中含有不同序列的DNA片断,它们是一些特异微生物种类的16SrDNA基因V3区的DNA片断,每个独立分离的DNA片断理论上可以代表一种微生物.各采样点水样中细菌DGGE图谱如图3所示,不同生态类型湖区样品经过变性梯度凝胶电泳(DGGE)都可以分离出数目不等的电泳条带,且各个条带的信号强度和迁移位置不同.电泳条带的多少基本上代表生物多样性,条带越亮,表示该种属微生物的数量越大,从而确定不同水样中所含有的微生物的种类和数量关系,得出其中微生物多样性的信息.从图3中可看出,各泳道都含有数目及迁移率各异的条带,lane1、2(代表贡湖湾水草区)条带数目较多,随着水体污染程度的加重,条带数量呈逐步降低的趋势,从水草丰富的贡湖湾湖区到超富营养的五里湖,细菌DGGE条带数量从33条降低到22条.从条带迁移率及灰度来看,各水样泳道间条带变化幅度较大.在五里湖的1#、2#采样点,微生物的DGGE指纹图谱表现为条带数目总量少优势条带明显的特点,随着水环境条件的改变和水体营养水平的下降,微生物的DGGE指纹图谱表现出优势条带的数目较少而总体条带数目明显增多的特征,在沉水植物区(贡湖湾)微生物群落表现出较高的相似性.从图3可看出,沉水植物区水体细菌的DGGE指纹图谱表现出明显增加的变化特征.4讨论4.1不同类型水体中细菌数量的变化从对不同湖区中细菌数量的结果来看,在太湖不同类型湖区水域中细菌的数量存在明显不同,从超富营养的五里湖(梅梁湾)到贫营养状态的湖心区,细菌数量呈显著下降趋势.在近岸的五里湖和梅梁湾水域中,外源输入的营养物质,加上大量藻类分泌物及藻类残体,这些易被微生物吸收的溶解性有机物,可能为细菌的生长提供了丰富的饵料(Bainesetal.,1991),从而促进了水体中细菌数量的大量生长(见图2),同时,浮游植物的大量生长,为水体中的浮游动物提供了充足的饵料,降低了浮游动物对细菌的捕食压力;在湖心水体中,由于远离沿岸带,受排污染影响较小,富营养化程度相对较低,浮游和底栖动物数量较多(李文朝,1996),而浮游藻类的数量下降(见表1),营养物质减少和原生动物捕食的双重压力使水体中微生物的数量减少;贡湖湾水生植被丰富区,植物的生长转移了水体及底泥中的营养物质,使水体中营养盐发生了转移,水体有机质的形态也因此发生了改变,水体中营养物质含量的降低,限制了水体中细菌的过量生长.结合本文所测得的水质参数,参照太湖富营养化程度评价标准(孙顺才等,1993)的相关指标,对太湖水体中细菌数量与富营养水平进行相关分析表明,太湖中细菌数量随水体富营养水平升高而增加(r=0.88)(见图4).对不同类型水体的研究表明,在营养水平较低的湖泊中,无机营养物质含量的大小可能是微生物生长的限制因子(Chrzanowskietal.,1995).而磷含量的高低常常成为水体中细菌数量的限制因素(Morrisetal.,1992;Toolanetal.,1991;Wangetal.,1992),在一定条件下,氮含量的多少也可能影响到微生物数量的变化(Markusetal.,1992),然而,在自然环境中,溶解性有机质的变化常常左右因氮磷比改变而引起的微生物数量的变化(Schweitzeretal.,1995).就太湖而言,尤其是靠近无锡市的五里湖和藻类长期出现梅梁湾这样的富营养湖区,加上从周围不断排入的营养物质,N、P已不是微生物生长的限制因子(冯胜等,2006).水体富营养化导致了浮游植物的生产力和生物量的提高,进而改变了浮游生物和底栖生物的群落结构(Smetaceketal.,1991).改变了传统食物连和微食物环的能量负荷,引起了高营养级生物资源的变化.4.2水体细菌群落多样性的变化运用16SrDNA-DGGE指纹分析方法对复杂环境的微生物种群有明显优势(Amannetal.,1995),但影响其分辨率的因素也很多,DGGE方法并不能对样品中所有的DNA片段进行分离(Vallaeysetal.,1997),只能对微生物群落中数量上大于1%的优势种群进行分析(Muyzeretal.,1993).而且这些方法可能在PCR过程中受变性时间的长短,双链铰链现象及退火温度不同等因素的影响而产生偏差(Ferrisetal.,1997),尽管存在这样那样的不足,但是到目前为止,用PCR-DGGE技术来研究不同环境中微生物群落变化,还是一种比较理想的工具(Muyzeretal.,1998).从本研究的细菌DGGE指纹图谱上可以看出,在太湖这种典型的富营养浅水湖泊中,由于水环境条件的改变及营养水平的差异,不同湖区水体中微生物的种群结构发生了显著变化,2000年曾经实施过底泥疏浚的五里湖和蓝藻频繁爆发的梅梁湾中水体细菌的多样性明显较低,而在沉水植物繁茂的贡湖湾里,水体细菌的多样性则相对较多,研究表明,在极度贫营养条件下,水体中微生物种类相对较少,随着营养水平的逐渐升高,微生物由于营养物质等生存条件的改变,多样性会增加(Chrzanowskietal.,1995).对太湖的研究表明,超富营养和接近超富营养湖区的水体中细菌群落多样性表现为减少的趋势.在梅梁湾中,尤其是秋冬季节由于微囊藻的分解水体中藻毒素的含量是显著增加的(许秋瑾等,2005),而五里湖几年前也是蓝藻高发区.这可能对某些微生物产生了毒害或抑制作用,限制了清水型微生物的生长繁殖,而一些生态幅较宽的耐污种则可利用浮游植物产生(分泌物或残体)的大量有机物而过量繁殖,因而产生了明显的特征条带(见图5);在贡湖湾中由于水生植物的生长,一方面降低了水体中营养盐的浓度(黄蕾等,2005),而且某些水生植物还可抑制水体中浮游植物(如微囊藻)的生长(Jones,1990),从而减少了水体中藻毒素的含量(Mitrovicetal.,2005;Yinetal.,2005),同时,沉水植物的生长又可吸收转化水体中一些有毒有害物质,给更多类型微生物的生长繁殖提供了优良场,从而增加了水体中细菌的群落多样性.对湖泊中微生物群落变化的研究已有很多(Lindström,2000;Vanderetal.,2001;Yannarelletal.,2004),而且,越来越多的研究开始关注引起这种变化的原因(Vanderetal.,2001;Yannarelletal.,2004).对Wisconsin(Yannarelletal.,2004)13个湖泊中