载体硕士课程培训课件

第五章载体

目前所用的载体有：

质粒

酵母质粒

噬菌体载体

病毒载体

粘粒

酵母人工染色体

按功能分为:克隆载体,表达载体

第一节质粒（plasmid）

一．什么是质粒

[质粒]染色体外能独立复制，能稳定遗传的一种环状双链DNA分子。

二．质粒的基本性质、分类和命名

1．质粒的分布、大小和数目

分布：细菌、酵母、霉菌和某些真核细胞

大小：106-2

810Dalton

例子：F1：6.2

106

ColE1:4.2

106

R64:7.8

106:

四环素，链霉素抗药性

质粒的理化性质

具有一般核酸分子的理化性质

质粒的生物学特性

寄生性──质粒只能在宿主的细胞内复制

稳定性──每种质粒在寄生虫细胞中总有

一定的拷贝数

同源性──不同质粒之间可能存在一定的

同源区。

重组性──两种不同的质粒处于同一宿主细胞

中或者一种质粒处于同一宿主中，

有可能发生质粒与质粒之间或质粒

与染色体之间的重组

不相容性──有相同复制起始区的不同质粒不

能共存于同一宿主细胞

传递性──有些质粒在细菌间能够传递、具有

转移性的质粒带有一套根转移有关

的基因。消除性──存在于宿主细胞中的质粒，可用

某些办法将它除掉。

复制类型──松驰型质粒的复制不受宿主

细胞蛋白质合成的严格控制。

表现型──不同的质粒有不同的表型特性。质粒的分类

按表型效应分：

①和质粒有关的性状是多方面的

②质粒能控制宿主的遗传性状─载体

③一种细菌可以具有不止一种表型效应

如：a．大肠杆菌的致育的因子（F）

b.大肠杆菌素因子（COlE1）抗药性质粒（R）

分解性质粒：假单孢菌中发现，如分解

樟脑的质粒

特殊性质质粒：致瘤脓杆菌的质粒，寄

主植物茎部长瘤状突起

隐秘性质粒：没有表型效应按拷贝数分

严紧型松弛型

转移类型：

1.转移型（接合转移）如：F因子

2.非转移型如：ColE1

不亲和群：可在同一细菌中共存的，

为不同不亲和群

命名

用小写字母p代表发现这一质粒的作者或实验室名称

如：pBR322，字母p代表质粒，

BR是构建该质粒的研究人员的姓名，322代表…构建的一系列质粒的编号。

质粒的分离和纯化

细菌的培养和质粒扩增

细菌的收集和裂解

质粒DNA的纯化

理想质粒载体所必需具备的条件

1.质粒较小

低分子量的质粒通常拷贝数较多克隆时所预期的基因表物的数量较大有可能找到合适的单一限制酶切点，便于制作酶谱外源DNA容量较大,质粒小容易转化（大于15kb时，成为转化效率制约因素)操作容易掌握，容易分离，不易断裂

2.带有可供选择的标记

对抗菌素的抗性，Amp,Tet,Cm,Kana,Neo,

互补

3.带有尽可能多的单一限制性酶切位点

单一的限制性酶切位点可供外源DNA定点插入；较多不同的单一限制酶酶切位点，可有选择地供带有不同末端的外源基因插入

4.具有复制起始点

质粒DNA增殖所必不可少的结构。

5.作为表达载体，还要有启动子和终止子序列等片段人工组建的克隆载体

pBR322

历史：最早载体质pSC101,ColE1,pCR1──复制效率低

没有选择标记

没有2个以上克隆位点

pBR322,──松弛复制，Tet和Amp抗药性，一些有用的RE切点太大，一半序列非必需

pBR322,去除非必需序列，

4.36kb现在的质粒多为其直系后裔

构建：ColE1复制区+pSC101.TcR基因+Tn3AmpR基因

特点：

应用：生长激素释放抑制因子的表达

pUC系列

pUC18/pUC19（2.69kb）

pUC118/pUC119（3.2kb）

一互补原理筛选

用途：

（1）克隆载体蓝白筛选

(2）DNA序列分析

118/119带有M13噬菌体的DNA合成、终止包装序列带质粒菌+M13K07辅助噬菌体产生SS.DNA,用于测序，体外诱变，链特异探针合成

（3）基因表达载体融合蛋白

第二节噬菌体类运载体

目前使用的噬菌体类运载体系主要有：

噬菌体衍生物

柯斯质粒（Cosmid）

M13噬菌体

噬菌体运载体

噬菌体的基本特点：

生活史

DNA结构：

双链，基因组大小为48.kb,线状两端带有单链12kb的互补末端，称为粘性末端

从J基因到N基因部份包含有功能不清的b2基因段以及与重组、整合和切离等溶源化有关的基因。

DNA长度不超过野生型DNA长度（48.6kb）的75~105%范围进行包装

噬菌体运载体

改造野生型

DNA：突变/缺失等手段消除过多的酶切位点及非必需区在非必要区插入外源基因（如lacZ基因）

改变噬菌斑的颜色、浊度等，以利筛选

插入型载体：

改造后使

DNA分子的中心仅有几个单一酶位点插入外源DNA片段，如

gt10

可克隆10kb外源片段

置换型载体：基因组中间部分约三分之一的基因组可以用外源基因进行替换，从而扩大载体的装载容量，如EMBL系列可克隆２0kb外源片段

．

粘粒（Cosmid）

粘粒是用基因工程技术组建的大肠杆菌质粒具有：

a．

噬菌体的Cos位点

b.整个pBR322的DNA顺序

c.可容纳35──45kb外源DNA

d.有抗性标记及多种限制性酶单切点

e.经感染进入细菌细胞以后，像质粒那样在细胞中复制

f.可以体外包装成噬菌体颗粒，以感染方式进入宿主细避开了大质粒转化因难的缺点

M13噬菌体运载体

M13是一种细线状的单链DNA噬菌体，在分子生物学研究中主要用于DNA的碱基顺序分析。

M13的生物学特性

M13只感染带有F+因子的雄性细胞（JM101，JM103等）

其DNA为环状单链分子，有6407个碱基组成。

生活史

M13载体的构建

M13DNA中有507个核苷核（3948～60