罗伊氏乳杆菌的研究进展

罗伊氏乳杆菌的研究进展

近年来，抗生素在人类和动物中的广泛使用，甚至滥用现象日益明显。长期使用抗生素会使人和动物肠道内的正常菌群失调,影响机体免疫功能的形成,甚至因长期滥用抗生素产生了具有多重抗药性的“超级细菌”。因此,寻找抗生素的替代品成为人类未来生存和发展的紧迫任务。益生菌可改善宿主微生态平衡,抑制病原菌生长,提高宿主免疫力和健康水平。罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)是目前已报道的几乎天然存在于所有脊椎动物和哺乳动物肠道内的乳酸菌。罗伊氏乳杆菌对肠黏膜具有很强的黏附能力,可改善肠道菌群分布,拮抗有害菌定植,避免罹患肠道疾病;罗伊氏乳杆菌能产生一种被称为“罗伊氏菌素(Reuterin)”的非蛋白质类广谱抗菌物质,能广泛抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母、真菌和病原虫等的生长。罗伊氏乳杆菌益生菌制剂可改善人体机能,提高免疫力从而促进人体健康。我国卫生部于2003年批准了罗伊氏乳杆菌可作为人类保健品的微生物菌种,且该菌已是国际上公认的新型益生乳酸菌,具有很高的理论研究和生产应用价值。对罗伊氏乳杆菌的研究早在20世纪80年代就已开始,对其各种益生功能的研究至今仍在继续,且新的研究成果层出不穷,使人们对罗伊氏乳杆菌的益生功能有了更全面的认识。本文将通过对罗伊氏乳杆菌良好的肠道定植能力和其产生的罗伊氏菌素的介绍,阐明其可能的益生作用机理,同时重点介绍罗伊氏乳杆菌促进人类和动物健康功能的研究进展。1碳黏附素及分子活性细菌黏附是一个非常复杂的细菌与宿主细胞相互作用的过程。细菌表面的黏附素与宿主细胞表面的相应受体结合之后,细菌便能牢固地黏附于宿主细胞上,并在该局部组织定居,大量繁殖。而肠道菌群在宿主肠道中的定植就是通过细菌的黏附性来实现的。因此,益生菌能否黏附于宿主肠道黏膜细胞表面形成稳定的优势菌群是发挥其众多生理功能的必要前提,而不能黏附于肠道黏膜细胞的细菌只能是过路菌而无法充分发挥其生理功能。罗伊氏乳杆菌是人和动物胃肠道中天然存在的乳杆菌之一,可承受胃酸和胆汁的作用而到达小肠的上部并黏附于小肠壁。对该菌黏附及定植能力的研究表明,罗伊氏乳杆菌细胞外存在黏附素,使其对宿主的黏膜黏液以及肠黏膜上皮细胞均表现较强的黏附能力。黏附素为乳酸菌表面普遍存在的结构成分,其主要成分多为分泌蛋白、糖蛋白、黏多糖类物质等。Miyoshi等用Caco-2细胞进行体外黏附模拟实验,证明罗伊氏乳杆菌104R存在一种表面蛋白MapA,其不仅参与黏膜黏液的黏附,而且同时参与肠上皮细胞的黏附。Roos和Jonsson研究表明罗伊氏乳杆菌1063可以编码一种358kDa的蛋白质,这种蛋白质可促进罗伊氏乳杆菌与黏膜黏液的黏附,而不同株罗伊氏乳杆菌是否能编码这种蛋白质对于该菌株与黏膜黏液的粘附强弱具有非常重要的作用。罗伊氏乳杆菌在肠道中的定植具有普遍性,目前还没有研究证明其定植位点具有特异的选择性,即无论对肠黏膜黏液,还是肠上皮细胞等多部位的体内实验及体外实验的Caco-2细胞系都可以检测到罗伊士乳杆菌的定植。Bjorkman的研究表明罗伊氏乳杆菌也可黏附在人结肠的上皮细胞。Jacobsen等选择47株乳酸杆菌通过设定特定筛选条件:pH2.5,胆盐浓度0.3%,对Caco-2细胞的黏附及是否抑制肠道致病菌而不抑制正常菌群等条件,从中筛选理想的益生菌。他们的研究结果显示只有5株符合以上条件,其中三株可以在人体中很好地定植,这三株中就包括罗伊氏乳杆菌,而且罗伊氏乳杆菌是这三株中唯一既具有很强的抑制病原微生物的能力又不会对肠道中正常菌群造成抑制的乳酸杆菌。另外,某些罗伊氏乳杆菌不仅可以黏附定植于肠道中,而且其菌体还可以分泌胞外物质抑制肠道致病菌的黏附定植。罗伊氏乳杆菌104R可以黏附于猪回肠的黏液层,而且还能分泌一种大小为1700kDa的胞外物质抑制产肠毒素大肠杆菌K88的生长定植。2罗伊氏菌素罗伊氏乳杆菌不仅具备乳酸菌主要的有益功效,而且还具备产生广谱抗菌物质的特效。罗伊氏乳杆菌能合成并分泌罗伊氏菌素,是一种为非蛋白质类广谱抗菌物质,可有效抑制有害菌的生长。罗伊氏菌素作为抗菌物质的优越性已引起人们越来越多的关注,也因其独特的生化特性及对人和动物安全无毒而具有十分广阔的应用前景。2.1罗伊氏菌素的分离纯化及其抗菌保鲜罗伊氏菌素,又称3-羟基丙醛(3-HPA),是甘油两步代谢的中间代谢产物。其代谢路径如图1所示,首先甘油在辅酶维生素B12和甘油脱水酶的作用下脱水产生3-羟基丙醛,并进一步通过辅酶NAD+和氧化还原酶作用还原成1,3-丙二醇。而在水溶液系统中,3-羟基丙醛的聚合和水合作用是可逆的,也就构成了3-羟基丙醛的动态系统。研究人员已分离并纯化出罗伊氏菌素,并通过核磁共振、质谱及红外分析等方法,确认罗伊氏菌素是一个以3-羟基丙醛单体为转换中心的复杂的动态混合体系,其成分包括3-羟基丙醛、3-羟基丙醛水合物及3-羟基丙醛的二聚体。在另一些细菌中也同样发现了此代谢路径,如克雷伯氏杆菌,但在这些细菌中,3-羟基丙醛只能作为一种短暂的代谢产物出现并很快被还原成1,3-丙二醇。而罗伊氏乳杆菌能合成超过自身需要量很多倍的3-羟基丙醛,并使之在体内得到大量稳定地积累。表明罗伊氏乳杆菌对其自身产生的罗伊氏菌素具有很强的耐受性,且为所有产生3-羟基丙醛的细菌中耐受力最强的。因此,高产罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌具有很大的工业应用潜力。2.2罗伊氏菌素可降低温度大多数乳酸菌所产生的细菌素或类细菌素只有很窄的抗菌谱,只能抑制与产生菌种属相近的一些细菌。而罗伊氏菌素是一种广谱有效的抗菌物质,能抑制埃希氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌、李斯特菌、弧菌、梭菌、葡萄球菌的生长。研究表明,罗伊氏菌素浓度在15~30μg/ml,可抑制革兰氏阳性菌和阴性菌、酵母、真菌及原生动物的生长,当浓度超过该范围4~5倍时,可杀死包括罗伊氏乳杆菌本身的乳酸菌。EI-Ziney和Debevere的研究发现,罗伊氏菌素可有效降低超高温瞬时灭菌(UHT)牛奶、松软奶酪及肉制品中单核细胞增生李斯特菌和大肠杆菌O175:H7的数量。Dobrogosz等将罗伊氏菌素添加到已感染细菌病毒(分别为大肠杆菌噬菌体λ和噬菌体8014-B2)的大肠杆菌或植物乳杆菌细胞中,结果发现罗伊氏菌素对病毒的复制同样具有有效的抑制作用。此外,大多数细菌素为多肽或蛋白质类物质,它们的抗菌特性通常受到蛋白酶的破坏,而罗伊氏菌素是由小分子水溶性中性物质组成的混合物,因而它的抑菌活性不会被蛋白酶破坏,具有更强的稳定性。2.3其他特殊的食品添加剂我国卫生部于2003年批准了罗伊氏乳杆菌可作为保健食品益生菌种。该菌合成和分泌的罗伊氏菌素具广谱抗菌特性,且对人和动物无害,在生物抑菌剂、抗感染治疗剂、生物交联剂、新型生物材料的前体等方面有着广泛的潜在用途。既可应用于食品、饲料、饮料等的防腐以提高产品货架期,又可作为生物抑菌剂,用于不能高温灭菌的食品牛奶、生物材料的灭菌;作为婴儿食品添加剂,用于调节婴儿肠道菌群分布;作为口香糖添加剂,用于杀死口腔病原菌以预防龋齿;作为抗感染治疗剂,替代抗生素用于动物病原虫引发疾病的治疗。此外,3-羟基丙醛还可以作为消毒剂和生物组织的固定剂,对生物体的毒害更小。3罗伊氏乳杆菌对小鼠隐头孢虫感染的影响益生菌对人和动物均显示出有效的益生功效,但其益生功效的具体机制尚未完全清楚。这些益生功效包括增强机体先天性和获得性免疫,刺激机体免疫器官的成熟,激活免疫系统,增加抗炎细胞因子的产生,降低肠道的渗透性等。Liu等最近研究发现,多种人源罗伊氏乳杆菌,包括DSM17938、ATCCPTA4659、ATCCPTA5289和ATCCPTA6475等均可通过单核吞噬细胞系统来刺激免疫调节反应,进而不同程度地减轻人类肠道炎症。Alak等用因腹腔接种LP-BM5白血病毒而患免疫缺陷症的C57BL小鼠作为实验对象,来检测罗伊氏乳杆菌对小球隐孢子虫的控制作用。接种LP-BM5病毒后,这些小鼠均会表现出淋巴结肿大,对小球隐孢子虫易感的症状。而先饲喂罗伊氏乳杆菌(108cfu/d)10天后再用小球隐孢子虫来感染小鼠,发现这些实验鼠的肠道上皮细胞均未感染小球隐孢子虫,而未饲喂罗伊氏乳杆菌的小鼠,在受小球隐孢子虫感染后的粪便中发现了小球隐孢子虫的卵母细胞。研究结果表明,罗伊氏乳杆菌有助于保护免疫缺陷的个体免受这种原生动物疾病的感染。另一些体内研究显示CD4+T淋巴细胞和小鼠干扰素-γ在机体抵抗感染中起着至关重要的作用。在饲喂罗伊氏乳杆菌的鸡回肠固有层中发现CD4+T淋巴细胞的数量与对照组相比显著增加,表明饲喂罗伊氏乳杆菌可能是通过提高淋巴细胞数量来促使机体抵抗感染的。罗伊氏乳杆菌对T细胞受体-α缺陷的小鼠同样具有保护作用。T细胞受体-α缺陷小鼠感染了小球隐孢子虫后,小鼠盲肠会出现炎性损伤,这种盲肠损伤主要是由炎症细胞渗入固有层致使大量上皮细胞增生所致。先将罗伊氏乳杆菌饲喂此种免疫缺陷型小鼠,再利用小球隐孢子虫感染,发现饲喂了罗伊氏乳杆菌的小鼠回肠和盲肠中的小球隐孢子虫数量明显少于对照组,且上皮细胞增生及盲肠发炎的现象明显好转。该研究表明,罗伊氏乳杆菌对维持免疫缺陷小鼠肠道黏膜的完整性,以及提高动物免疫力具有明显的促进作用。Anukum等利用罗伊氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌,观察其对由尿道共生致病菌引起尿道感染的治愈效果。结果表明,乳杆菌可以通过下调患者神经性膀胱中的TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10和IL-12而使患者膀胱炎的症状得以减轻。4罗伊木蓝草菌在人类和动物疾病中的相互作用4.1罗伊木蓝对动物健康的影响研究4.1.1对肠道特异性罗伊氏乳杆菌的作用目前常用化学药剂对实验鼠进行肠炎诱导,常使用的化学药剂有乙酸或甲氨蝶呤等。Fabia等建立了一个由乙酸诱导大鼠患上溃疡性大肠炎的实验动物模型。他们发现,在进行乙酸饲喂后立即以5×107~7×107cfu的剂量饲喂大鼠肠道特异性罗伊氏乳杆菌,可阻止溃疡性大肠炎的炎症发展。甲氨蝶呤(MTX)是一种应用于人类的抗肿瘤化学药物,也可作为治疗类风湿疾病的药物。但该药会引起细胞毒素对肠道黏膜的伤害,破坏胃肠道微生态平衡,引起严重的小肠结肠炎。向大鼠腹腔内注射MTX可引起严重的非穿孔性小肠结肠炎,同时伴随体重骤减、黏膜组织物减少及肠道屏障损伤等症状。Mao等的实验证明罗伊氏乳杆菌有助于建立肠道微生态平衡,降低由细菌转移引起的肠道通透性损伤,即有助于削弱由MTX诱导产生的大鼠小肠结肠炎。他们还发现添加罗伊氏乳杆菌或植物乳杆菌会显著增加回肠结肠分泌的IgA水平,同时提高CD4+和CD8+的数量。4.1.2罗伊氏乳杆菌的喷雾对agd的影响刚孵化的禽类常因感染细菌或受环境应激易造成生长抑制甚至死亡,此种现象称作禽类生长抑制现象(AGD),已成为严重影响禽类养殖生产的病症之一。Ivan等证明同样是经低温冷应激的幼雏,经罗伊氏乳杆菌液喷雾及饲喂罗伊氏乳杆菌(106cfu)处理的实验组均表现出较对照组更少的死亡数和平均体重的显著增加。另外,幼雏也常因饲料配方中蛋白质含量不足而引起生长抑制,饲料营养的不足是引起AGD另一主要原因。Dunham等的实验中用含有罗伊氏乳杆菌的预防剂进行饲喂发现小鸡的生长迟缓得到了非常显著的改善。以上表明饲喂罗伊氏乳杆菌可显著调节应激诱导的及营养不足诱导的生长抑制。4.1.3两组大鼠腹泻的发生率仔猪较易发生由小球隐孢子虫引起的腹泻。Dobrogosz等的实验是将饲喂罗伊氏乳杆菌的仔猪组与不饲喂罗伊氏乳杆菌的对照组进行比较,记录发生腹泻的起始时间及腹泻的严重程度。结果表明添加罗伊氏乳杆菌的处理组发生腹泻的仔猪数量明显减少,且发生腹泻的严重程度也有明显减轻。证明罗伊氏乳杆菌剂对由小球隐孢子虫引起的仔猪腹泻有明显的调节改善功效。4.1.4对饲养罗伊氏乳杆菌生长和饲料利用的影响实验室中的实验已验证了罗伊氏乳杆菌的诸多益生效用,在此基础上更需要明确其在商业化养殖环境下是否具有类似功效。Casas等在16个火鸡养殖场中进行了该项实验,实验涉及火鸡总量为280000只。将每572只火鸡随机分成一组,在其孵化到生长42天的过程进行体重记录。结果表明,饲喂罗伊氏乳杆菌的有益功效在饲喂开始后的几天内就很快显现出来。对照组火鸡的平均体重为3.8lbs,而饲喂罗伊氏乳杆菌的处理组的平均体重为4.2lbs,处理组体重较对照组有9.5%的增长,即饲喂罗伊氏乳杆菌组表现出较对照组更好的生长势头。另外,分别对16个商业化养殖场各自的实验数据进行统计表明,用孵化后4个月大上市年龄期的火鸡作实验对象的12个组的实验效果更为明显,即通过饲喂罗伊氏乳杆菌使各个生产指标,包括存活率、饲料转化率、体重、A级质量的禽类数量等都得到显著改善。证明无论在实验室条件还是商业生产条件下,罗伊氏乳杆菌作为益生菌饲喂动物均可表现出一致的良好效用。4.1.5罗伊氏乳杆菌添加对猪生长和饲料利用的影响Blanchard等的相关实验表明,用罗伊氏乳杆菌,以及添加优质调味料的饲料分别饲喂断奶前后仔猪,按照饲喂方式的不同分为三组:第一组(n=44)为对照组,不加高铜、抗生素及罗伊氏乳杆菌;第二组(n=41)按照商业饲料配方饲喂,其配方中添加了高铜和抗生素;第三组(n=53)用添加了罗伊氏乳杆菌的饲料进行饲喂,其添加剂量按每头猪每天含108cfu罗伊氏乳杆菌计。测定仔猪断奶前的出生重量和生长速率,以及测定断奶后21天仔猪的生长速率和饲料转化率。结果表明,在断奶前的实验中,罗伊氏乳杆菌添加处理组及抗生素添加处理组的各数据指标较对照组都未表现出明显的优势;然而在断奶后的实验中,饲喂罗伊氏乳杆菌组的生长速率有了明显的提高,同时该组的猪表现得更洁净更健康。而综合评价整体促生长功效,则罗伊氏乳杆菌处理组和抗生素处理组的效果趋于一致,且都优于对照组。可见,饲喂罗伊氏乳杆菌对促进仔猪生长可与添加抗生素组达到一致水平,表明在某些动物养殖中添加罗伊氏乳杆菌的确可作为抗生素的替代品,而且是促进畜禽生长的一种可选的新型生物促生长方式,从而削弱由于抗生素使用所致不同物种间病原菌对抗生素的耐药性。4.2罗伊氏乳杆菌的治疗腹泻是儿童最常见的病症。在急性腹泻期,原有的正常肠道菌群包括乳酸杆菌、双歧杆菌、拟杆菌等,发生快速的改变。多项研究表明,乳酸杆菌的共生会加速宿主肠道微生物群恢复其原有的良好状态,从而调节急性腹泻患者肠道内的菌群稳态。Shomikova等用从人母乳中分离的罗伊氏乳杆菌进行实验,实验对象是6~36月龄的患有急性腹泻的儿童;其中75%的患儿腹泻是由轮状病毒引起。实验检测了处理后水样腹泻的持续时间,罗伊氏乳杆菌组是1.7天,安慰剂组(Placebo)是2.9天;继而统计了处理后第二天腹泻未愈人数的比例,罗伊氏乳杆菌组为26%,安慰剂组为81%。从而证明罗伊氏乳杆菌对治疗儿童轮状病毒腹泻有良好的治疗效果。另外,Shornikova等的另一个实验证明罗伊氏乳杆菌治疗腹泻的功