三聚氰胺的毒性和亚慢性毒性研究

三聚氰胺的毒性和亚慢性毒性研究

自2007年3月中旬以来，美国发生了4000多起猫、狗等中毒事件。美国食品药品管理局从进口的部分小麦蛋白粉和大米蛋白粉中检出三聚氰胺等成分。三聚氰胺多用于生产塑料和肥料,还可制造药物胶囊。在动物饲料中添加三聚氰胺,可提高饲料的氮含量,让人误以为该饲料的蛋白质比较丰富,但目前还没有被认定有害人体健康,有关它和其他物质混合后对动物产生何种影响的资料报道甚少。本试验通过对三聚氰胺的细胞毒性、急性毒性和亚慢性毒性研究,客观评价动物长时间接触该化合物的危害性,以及为中毒动物的治疗提供理论基础。1材料和方法1.1动物中心动物中心BHK细胞(由中国人民解放军事医学科学院提供);昆明小鼠,清洁级,体重18g~22g,雌雄各半,(购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心);成年健康猫(购自北京大学医学部实验动物中心)。1.2仪器、试剂和仪器三聚氰胺(北京化学试剂公司),DMEM培养液,胎牛血清(美国GIBCO公司),MTT溶液(美国Sigma公司),倒置相差显微镜(Dmil型,美国leica公司),酶标仪(Accent型,美国Thermo公司),CO2培养箱(3111型,美国Thermo公司),生化分析仪(saba18意大利),石蜡切片机(Leica美国)。1.3方法1.3.1体外细胞中dmem检测将三聚氰胺用培养液加热搅拌溶解,甘油助溶,配成5mg/ml的溶液然后在无菌条件下进行3倍稀释备用。将对数生长期的BHK细胞消化、计数,用含体积分数为10%的胎牛血清的DMEM培养液配成浓度为5×104个/ml的细胞悬液,按200μl/孔的密度接种于96孔培养板,37℃、5%CO2温箱培养使细胞贴壁。24h后弃去旧培养液,加入不同浓度的样品200μl,每个稀释度作5个平行孔,继续培养20h后加入MTT,每孔20μl,再培养4h,弃去液体后加入100μlDMSO震荡10min,立即在酶标仪570nm波长处测各孔A值。同时设对照组。重复上述实验三次。细胞活力存活率%=((样品A值-空白组A值)/(阴性对照A值-空白组A值)×100%。1.3.2灌胃水到所需剂量的测定称取需要的三聚氰胺量,用研钵研磨后加蒸馏水到所要求的浓度。选择健康小鼠,采用灌胃方式从低剂量给药,每组6只小鼠(雌雄各半),观察48h。小鼠死亡后剖解观察。1.3.3对血药浓度与采血量的添加量实行添加试验将试验猫随机分为2组,每组3只,按照美方提供的饲料中三聚氰胺含量为2.4g进行添加,采用30d连续喂养试验,并于饲喂后第6、9、15、23、30d采血做生化指标检查。实验结束后将实验猫处死,取肾脏固定于体积分数为5%的甲醛中1~3h,常规石蜡制片。1.4ic50的计算IC50是将细胞存活率对浓度对数作图,按作图法用ED50andIC50FORGradedResponse(Ver1.2,日本H.Ono开发)程序计算出IC50。2结果2.1细胞存活率测定不同浓度的样品对BHK细胞作用24h后,MTT法测定A570,计算细胞的存活率,结果见表1。统计分析结果表明,三聚氰胺在高浓度时(≥1.667mg/ml)与细胞存活率显著相关(P<0.05),计算IC50为10.11mg/ml。2.2小鼠脏器未见状态最高剂量组给药后9h,小鼠开始出现不安,呼吸急促,随后在几十min内死亡。其他剂量组小鼠仅见精神不振,反应迟钝,闭眼伏卧,不食等症状,随后在24~48h出现个别死亡。灌胃死亡的小鼠输尿管中均有大量晶体蓄积,部分小鼠肾脏被膜有一层晶体。其他脏器未见有明显的变化。三聚氰胺急性毒性实验小鼠死亡情况见表2,三聚氰胺的全部不致死的最大剂量大于5000mg/kg。2.3-添加三聚氰胺后猫血清尿素氮(BUN)和肌酐(CRE)的变化见图1~2。当饲料中添加三聚氰胺后,血清BUN和CRE逐渐升高,到23d这两项指标超过正常范围(正常范围:BUN:5.4~13.6mmol/L,CRE:62~190μmol/L)。2.4组织病理学的变化猫在饲喂三聚氰胺30d后,肾脏中可见淋巴细胞浸润,肾小管管腔中出现晶体(图3)。3聚氰胺hplc厂商在植物蛋白粉中添加三聚氰胺的原因,是三聚氰胺物理性状为白色单斜晶体、无味,这与蛋白粉相仿,此物质易于购买和生产,成本很低,而三聚氰胺含氮量高才是最根本原因。蛋白质主要由氨基酸组成,其含氮量一般不超过30%,而三聚氰胺的分子式显示,其含氮量为66%左右。由于“凯氏定氮法”只能测出含氮量,并不能鉴定饲料中有无违规化学物质,所以,添加三聚氰胺的饲料理论上可以测出较高的蛋白质含量。国内已经有采用高效液相色谱法(HPLC)法检测饲料和工业品的三聚氰胺的含量,该方法更为灵敏,简单。三聚氰胺的全部不致死的最大剂量5000mg/kg。参考国家药物急性毒性分级标准,LD50>5000mg/kg,可以初步认定为微毒或基本无毒。三聚氰胺的亚慢性毒性试验结果显示,实验组和对照组血常规检测正常,实验组的血清BUN和CR