南京地区乙型肝炎病毒基因型多对型特异性引物pcr分型原理及初步应用

南京地区乙型肝炎病毒基因型多对型特异性引物pcr分型原理及初步应用

目前，基于完全氨基酸序列的比较表明，hbv可分为8个基因型。a、b、c、d、e、f、g和h。基因型反映了HBV自然感染过程中的变异特点,是病毒变异进化的结果。HBV常发生前C区突变,最常见的是前C区1896位点突变,由鸟嘌呤(G)转变为腺嘌呤(A),最终导致HBeAg合成中断。为了探讨南京地区HBV基因型与前C区1896变异的相关性,我们进行了如下的研究。1数据和方法1.1v感染情况随机选择南京地区2004年3月～2005年3月HBV-DNA阳性(荧光PCR)的HBV感染者220例,男142例,女78例,年龄20～68岁,平均42.6岁,其中急性乙肝26例,慢性乙肝100例,慢性重型乙肝56例,乙肝肝硬化38例。排除甲、丙、丁、戊肝炎病毒重叠感染。患者均符合2000年西安会议修订的《病毒性肝炎防治方案》诊断分型标准。1.2实验方法1.2.1多对型特异性引物pcr反应采用多对型特异性引物PCR法检测HBV基因型,分型原理及引物设计参照文献。根据从前S1基因到S基因的保守序列,设计出外引物2条,内引物8条。每条内引物均具有型特异性。将50μl浓缩液与50μl待测血清标本混匀,8000r/min离心10min,弃掉上清液留下沉淀,将10μlHBV裂解缓冲液与沉淀混匀,振荡15min。开水浴10min,14000r/min离心15min,取上清液2μl做多对型特异性引物PCR反应。PCR反应在Icycler仪(Bio-Rad,USA)中进行。首先用外引物进行第1次PCR,PCR反应系统组成为:待检上清液2μl、TaKaRaExTaq酶(2U/μl)1μl、10×ExTaqBuffer(Mgplus)5μl、dNTPMixture1μl,引物1、引物2各1μl,加灭菌蒸馏水至50μl反应体积。扩增条件:95℃预变性600s,94℃变性60s,55℃退火30s,72℃延伸60s,共扩增35个循环。将扩增产物引入内引物进行第2次PCR。PCR反应体系除引物不同外其他成分与第1次PCR一致。扩增条件:95℃预变性300s,94℃变性60s,58℃退火30s,72℃延伸30s,共扩增20个循环。扩增的靶基因经琼脂糖凝胶电泳(100伏电压)鉴定,并根据不同的电泳图谱进行分析以确定HBV基因型。1.2.2突变株特异性引物扩增采用MsPCR法,对同一血清标本分别采用野生株和突变株特异性引物进行扩增。扩增的靶基因经琼脂糖凝胶电泳(100伏电压)鉴定,并根据不同的电泳图谱进行分析以确定HBV变异株(包括混合感染株)和野生株。1.2.3u3000叶片型通过扩增产物的片段大小可以准确鉴定HBV型:扩增出68bp大小片段为A型,281bp片段为B型,122bp片段为C型,119bp片段为D型,167bp片段为E型,97bp片段为F型。1.3统计方法计数资料采用χ2检验(SPSS10.0)。2结果2.1基因型检测结果对南京地区220例HBV-DNA阳性的HBV感染者进行基因型检测,基因型B71例,占32.3%,基因型C146例,占66.4%,基因型D1例,B+C混合型1例,A+B混合型1例,未发现基因型A、E、F存在。2.2hbv前c区1896年的变异植物和野生植物220例患者中有163例发生了前C区1896位变异,变异株检出率(单纯变异株/混合变异株)为74.1%。2.3基因型c的表现基因型B有56例(78.9%)发生了前C区1896变异,基因型C有97例(66.4%)发生了变异,两组前C区1896总变异(单纯变异株/混合变异株)发生率间差别有显著性意义(χ2=4.56,P=0.035,见表1)。3hbv基因型b前c区的变异HBV常发生前C区突变,最常见的是前C区1896位点突变。该区1896位G→A变异使前C区第28位氨基酸密码子由TGG(色氨酸)变成TAG(终止密码),从而终止HBeAg合成,使血清中HBeAg阴性。有关不同HBV基因型与前C区1896位点变异是否存在相关性,目前还少有研究报道。本研究显示:南京地区HBV前C区1896位变异株检出率(单纯变异株/混合变异株)为74.1%;不同HBV基因型HBV感染者病毒基因组前C区1896变异率基因型B为78.9%,基因型C为66.4%,两组变异率不同。提示:南京地区HBV基因型B前C区1896变异比基因型C更为多见。本研究发现南京地区HBV基因型C为优势基因型占66.4%,基因型B占32.3%,基因型D1例,B+C混合型1例,A+B混合型1例,未发现基因型A、E、F存在,结果与国内文献报道基本一致。基因型D、B+C、A+B未发现其前C区1896位点变异。目前HBV基因分型方法有病毒基因组或S基因序列测序、单克隆酶联抗体免疫吸附法、聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)、ELISA、多对型特异性引物PCR等多种方法。多对型特异性引物PCR法相对其他分型方法具有简单快速、准确度和特异度较高等优点。HBV基因型的地理分布具有一定的区域性。A型主要分布于欧洲北、西部和非洲撒哈拉沙漠地带;B、C型主要分布于亚洲东、南部;D型是分布最广泛的基因型,是地中海地区和近东如印度的优势基因型,也发现于亚洲少数民族;E型主要分布于非洲撒哈拉沙漠地带;F型主要分布于南美、美国的土著族人口中;G型主要分布在法国和美国;H型分布于墨西哥和美国。我国HBV基因型南方以B型为主,北方以C型为主,D型仅见于西部及少数民族地区。也有学