高脂血症小鼠模型的建立及降血脂保健食品功能检测研究

高脂血症小鼠模型的建立及降血脂保健食品功能检测研究

在19世纪，人们的生活水平显著提高。同时，与生活方式相关的疾病已成为威胁人类健康的主要原因。在我国心脑血管疾病的死亡率已经上升到第二位。高血脂症,即血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白的增高是引起心脑血管疾病的一个主要原因。大量的流行病学调查和研究均表明,高脂血症是动脉粥样硬化(AS)、冠心病(CHD)、高血压、糖尿病、胆石症等多种疾病的重要危险因素,严重危害人类健康。因此,研究能够调节血脂的保健食品对预防疾病,保护人民身体健康有重要的意义[1～5]。然而,在高血脂症的机制研究、新型保健食品开发及新药研究中,都需要快捷、准确、质量稳定的高脂血症动物模型。目前制备高脂血症动物模型主要有表面活性剂法、免疫学法、同型半胱氨酸法、转基因法及高脂饲料喂养法等等。其中高脂饲料喂养法由于其简便易行是目前国内建立高血脂动物模型的常用方法。由于大鼠代谢较稳定,且血量充足,造成高血脂动物模型的成功率高,因此在降血脂保健食品研究中通常采用大鼠制备高血脂模型。但是饲养大鼠占地面积大,所用高脂饲料消耗多。如果用小鼠代替大鼠,饲养经费能够节省约2/3,且动物房使用面积能够节省约4/5。由于小鼠的代谢情况与大鼠有很大不同,能否用小鼠建立起稳定的高血脂模型,进而代替大鼠进行降血脂保健食品功能评价研究是本课题要解决的问题。为此,我们采用高脂饲料喂养法,观察小鼠进食高脂饲料60d内血脂变化情况,观察比较两种降血脂保健食品对高血脂小鼠和高血脂大鼠血脂各项指标的影响,从而对高血脂小鼠模型的稳定性和在降血脂保健食品功能检测研究中的实用性进行初步评价。1材料和方法1.1动物及微生物选用北京维通利华实验动物技术有限公司繁殖的健康清洁级21～26g昆明种雄性小鼠72只,150～200gWistar雄性大鼠48只[许可证号:SCXK-(京)2002-0003]。1.2仪器和试剂1.2.1仪器755型分光光度计;恒温水浴锅;离心机;搅拌器。1.2.2中生北控生物技术总胆固醇试剂盒中生北控生物技术股份有限公司;甘油三酯试剂盒中生北控生物技术股份有限公司;高密度脂蛋白胆固醇试剂盒中生北控生物技术股份有限公司。1.3降血脂饮食功能红曲醋1号义乌丹溪酒业有限公司;功能红曲醋2号义乌丹溪酒业有限公司。2结果与分析2.1脂肪狗模型的制备和稳定性的观察2.1.1动物分组及处理小鼠给予正常基础饲料7d后,眼眶取血,分离血清,测定血清中总胆固醇(TC),甘油三脂(TG)。根据TC水平随机分为两组:正常对照组和高脂模型组,每组12只。高脂模型组进食高脂饲料(78.8%基础饲料、1%胆固醇、10%蛋黄粉、10%猪油、0.2%胆盐)。正常对照组进食正常基础饲料。两组动物均饮用自来水(经紫外消毒)。在喂养过程中的30、45、60d,分别从正常对照组小鼠和高脂模型组小鼠眼眶取血,测定TC和TG。2.1.2高脂饲料对小鼠血清总胆固醇的影响由表1可见,实验前高脂模型组小鼠血清总胆固醇与正常对照组比较,差异无显著性(p>0.05)。正常对照组小鼠实验第30、45和60d,与本组实验前比较,血清总胆固醇无显著性差异(p>0.05)。而饲喂高脂饲料的小鼠实验第30d与本组实验前比较,血清总胆固醇显著升高(p<0.05);实验第30、45和60d,饲喂高脂饲料的小鼠其血清总胆固醇水平显著高于正常对照组。从表1中还可以看到,进食高脂饲料30～60d,高脂模型组小鼠血清总胆固醇始终维持在一个高的水平上。可见,在喂食小鼠高脂饲料第30d,小鼠TC就有明显升高,且在造成高胆固醇动物模型之后的30d内能继续维持。2.1.3高脂模型小鼠血清酯类基因型的影响由表2可见,实验前高脂模型组小鼠血清TG与正常对照组比较,差异无显著性(p>0.05)。正常对照组小鼠饲喂正常基础饲料60d中,血清甘油三酯无显著性变化,一直处于本组实验前的水平(p>0.05)。而饲喂小鼠高脂饲料30d后,与实验前比较,高脂模型组小鼠血清甘油三酯显著升高(p<0.01);而在造成高甘油三酯动物模型后的30d当中,高脂模型组小鼠血清甘油三酯仍能继续维持在这个高水平上。综合表1和表2的结果可知,给小鼠饲喂高脂饲料30d可以造成高血脂模型,在继续饲喂高脂饲料30d里,观察到此高血脂模型能够继续维持。2.2脂肪狗模型的实用性和可行性的评价2.2.1功能红曲醋小鼠血脂指标变化给予小鼠正常基础饲料7d后,禁食12h,眼眶取血,分离血清,测定血清中TC、TG和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)。根据TC水平将小鼠分为四组:正常对照组﹑高脂对照组﹑功能红曲醋1号组﹑功能红曲醋2号组,每组12只。功能红曲醋1号组﹑功能红曲醋2号组饲喂高脂饲料(78.8%基础饲料、1%胆固醇、10%蛋黄粉、10%猪油、0.2%胆盐),同时每日一次灌胃按1:4(醋:水)稀释的功能红曲醋,小鼠灌胃体积为0.2ml/10gbw。高脂对照组饲喂高脂饲料,正常对照组饲喂正常基础饲料,高脂对照组和正常对照组每日一次灌胃与功能红曲醋组同体积的自来水(经紫外消毒)。连续给予受试物53d后禁食12h,测定各组动物血脂三项指标,用SPSS软件进行数据处理统计。由表3可见,实验前功能红曲醋1、2号组小鼠TC与高脂对照组比较,差异均无显著性(p>0.05)。实验53d后,高脂对照组与本组实验前比较TC含量显著升高,表明小鼠高TC模型制备成功。此时灌胃功能红曲醋53d的2号组小鼠血清TC含量显著低于高脂对照组(p<0.05),表明功能红曲醋2号具有降低血清总胆固醇含量的作用。从表3中还可以看到,实验前功能红曲醋1、2号组小鼠TG与高脂对照组比较,差异均无显著性(p>0.05)。实验53d后,高脂对照组与本组实验前比较TG含量显著升高,表明小鼠高TG模型制备成功。此时灌胃功能红曲醋53d的1、2号组小鼠血清TG含量均显著低于高脂对照组(p<0.05),表明功能红曲醋1、2号均具有降低血清甘油三酯含量的作用。从表3中还可知,给予小鼠相同剂量的功能红曲醋53d后,两个实验组血清HDL-C与高脂对照组比较均无显著变化(p<>0.05)。表明功能红曲醋1、2号对高血脂小鼠HDL-C含量无显著影响。2.2.2小鼠血脂指标的测定动物分组及饲喂情况同2.2.1。功能红曲醋1号组、功能红曲醋2号组每日一次灌胃按1:4(醋:水)稀释的功能红曲醋,大鼠灌胃体积为1ml/100gbw,高脂模型组和正常对照组每日一次灌胃与功能红曲醋组同体积的水。连续给予受试物53d后禁食12h,测定各组动物血脂三项指标。由表4可见,实验前,功能红曲醋1,2号组大鼠TC、TG、HDL-C与高脂对照组比较,差异均无显著性(p>0.05)。实验53d后,高脂对照组与本组实验前比较TC、TG含量显著升高,表明高脂模型制备成功。此时灌胃功能红曲醋53d的2号组大鼠血清TC含量显著低于高脂对照组(p<0.05),表明功能红曲醋2号具有降低血清总胆固醇含量的作用。灌胃功能红曲醋53d的1、2号组大鼠血清TG含量均显著低于高脂对照组(p<0.05),表明功能红曲醋1、2号均具有降低血清甘油三酯的作用。两个实验组与高脂模型组比较,功能红曲醋1、2号组大鼠血清HDL-C差异均无显著性(p>0.05)。说明功能红曲醋1、2号对高血脂大鼠HDL-C无显著影响。2.2.2实验结果得到的结论与用小鼠为实验材料所进行实验得出的结论相一致。3不同降血脂保健功能评价实验扩大的结果分析据不完全统计,我国近年来心脑血管疾病占我国居民总死亡原因39.4%。而这些心血管疾病,绝大多数是由于高血脂导致的动脉硬化而引起的。因此,如何能找到一种有效的保健食品,在人们日常饮食的过程中就可以起到对血脂的控制、对心脑血管的保护已经成为本世纪保健食品领域的重大研究热点。然而,任何一种保健食品在上市前,都要经过多次动物实验,不断探索出最合适的配方及生产工艺,这就需要首先建立高血脂动物模型。用大鼠为实验材料做这些前期工作无疑要花费大量的经费,如果能用小鼠代替大鼠做保健品的前期配方筛选工作既可减少经费又能节省空间。对于降血脂保健食品功能评价实验,如果用小鼠取代大鼠,存在三个要解决的问题。一是在降血脂保健食品功能评价研究的动物实验中,测定规定的血脂三项指标,用常规的试剂盒方法,每只动物的最少采血量也需要500μl。用大鼠为实验材料勉强可行,而以小鼠为实验材料就会出现采血量过大导致动物失血过多的问题。这一问题在本实验室已经得到解决。第二个问题是小鼠高血脂模型建立成功后在整个实验期间是否稳定。尽管目前有一些用小鼠为实验材料进行保健食品降血脂功能评价实验的报道,在这些报道中也都建立了小鼠的高血脂模型,但很少有关于高血脂模型建立后是否能够在整个实验期间稳定的研究报道。小鼠代谢情况与大鼠有很大差别,如果实验中建立的小鼠高血脂模型在给予受试物阶段不稳定,就会给实验结果带来很大误差。因此本文研究了在本实验条件下所建立的小鼠高血脂动物模型的稳定情况。从表1的结果可以看到,给小鼠饲喂高脂饲料30d后,与本组实验前及与对照组比较,小鼠血清TC和TG含量显著升高(p<0.05);而在造成高血脂动物模型后的30d当中,高脂模型组小鼠血清TC和TG含量一直能够维持在这个高水平上。实验结果说明用本实验方法所建立起来的小鼠高血脂模型在进行保健食品降血脂功能评价实验期间是稳定的。第三个问题是用小鼠为实验材料进行降血脂保健食品功能评价实验,其结果是否与用大鼠进行同一实验的结果相一致。表3、4的结果,是大鼠与小鼠在同一时间,在相同的实验条件下,分别灌喂相同两种受试物后所得到的结果。这两个表的结果相比较,特别是两个实验所得出的结论相比较可以看到也是一致的。因此这个实验证明了在降血脂保健食品功能评价实验中用小鼠代替大鼠基本上是可行的。用大鼠进