下载本文档
版权说明:本文档由用户提供并上传,收益归属内容提供方,若内容存在侵权,请进行举报或认领
文档简介
多重PCR反应中关键因素和实验步骤⑴adminO.Henegariu,N.A.Heerema,S.R.Dlouhy,GH.VanceandP.H.VogtIndianaUniversity,Indianapoils,IN,USAandHeidelbergUniversity,Heidelberg,Germany摘要:多重PCR通过在同一个反应中同时完成多个基因的扩增成为临床与基础研究领域中一种简便快捷的筛选检测方法。已有大量文献详细的讨论了通常影响PCR反应质量的条件,而在多重PCR中常见的困难和重要的实验因素却鲜见报道。本文使用多对引物对多重PCR的各种条件进行了研究。研究表明,对于成功进行多重PCR尤为重要的因素是:用于扩增不同基因的不同引物对之间的相对浓度、PCR缓冲液的浓度、循环温度、氯化镁和dNTP浓度间的平衡。在实验的基础上,本文给出了一个多重PCR的标准方法,并给出常见问题的解决办法。介绍:多重PCR就是在同一个反应管中同时完成多个不同基因扩增的PCR反应。这一方法最早报道于1988年(6),已被成功的用于缺失分析(2,8),突变(14)与多态性(11),以及定量分析(10)与反转录PCR(7)等多个DNA检测领域。PCR反应中各种试剂的作用已被讨论过(3,9,12,13),也已有许多研究团体对多重PCR的方法进行了描述。但是很少有人对影响多重PCR结果的因素(如引物浓度、循环条件等)进行过深入的讨论(5,15)。本实验使用常规含KCl的PCR缓冲液对50种基因的各种组合进行了多重PCR反应,针对伴随多重PCR的一些问题,如均一性差、某些基因难以扩出、重复性差等问题,对影响扩增的相关参数进行了研究。基于实验经验我们设计了多重PCR的标准方法(Figure1),并提供了对可能碰到的许多问题的解决方案,这对于临床与基础研究领域中使用PCR技术的工作者都会有所帮助。材料与方法:PCR使用的标准溶液和试剂100mM母液的核苷酸(dNTP)(购于PharmaciaBiotech[Piscataway,NJ,USA]或BoehringerMannheim[Indianapolis,IN,USA])(25mMeachdATP,dCTP,dGTPanddTTP).标准的lOxPCR缓冲液(Perkin-Elmer,Norwalk,CT,USA)包含:500mMKCl,100mMTris-HCl,pH8.3[at24°C],15mMMgCl2.TaqDNA聚合酶(LifeTechnologies[Gaithersburg,MD,USA];Perkin-Elmer).二甲亚砜(DMSO),牛血清蛋白(BSA),甘油(SigmaChemical[St.Louis,MO,USA])引物(Genosys[TheWoodlands,TX,USA];ResearchGenetics[Huntsville,AL,USA])(终浓度为10-25pmol/吐。引物对sY用作检测Y染色体上的缺失(8,16);还有10-15对引物用于检测X染色体上迪谢内肌营养不良基因(DMD)⑷;其余引物用于检测12号染色体上的多态性位点,引物按Table1和Figures2b,3b,5e方案组合。基因组,DNA使用标准SDS/蛋白酶K方法制备(BoehringerMannheim)基本PCR程序PCR反应体积为25吐,包括:灭菌的超纯水、PCR缓冲液(1x)、dNTP混合物(200yMeach)、引物(0.04—O.6yMeach);DMSO,甘油或BSA(5%);TaqDNA聚合酶(1-2U/25yL)和基因组DNA模板(150ng/25yL)。先加入水,其它组分可以任意顺序加入,加样在冰上进行,加样完成后反应管直接从冰上转入预热到94C的循环仪加热模块或水浴中。对于放射性标记的反应,在反应开始前立即在lOOyL的反应混合液中加入1yCi[32P]dCTP(Amersham,ArlingtonHeights,IL,USA)。使用100yL、25yL、6.2yL反应体积得到的结果相同,对于小的反应体积,加样(尤其是dNTP)至关重要。实验中使用了各种PCR仪,经过细微调节后都得到了好的实验结果。PCR产物的凝胶分析在3%SeaKem?LE或NuSieve?(3:1)琼脂糖凝胶(FMCBioProducts,Rockland,ME,USA)上对X、Y染色体上非多态性位点的PCR产物进行分离,电泳缓冲液分别为1xTAE[0.04MTris-acetate;0.001MEDTA(pH8.0)]或1xTBE[0.09MTris-borate;0.002MEDTA(pH8.0)]缓冲液,电泳在室温下进行,电场强度为7-10V/cm。PCR产物的上样体积相同,电泳后凝胶用0.5—1卩g/mLEB染色。当检测位点为多态性位点或需要更高的分辨率时使用测序胶(6%聚丙烯酰胺[PAA]/7M尿素)。与上样缓冲液混匀后,每泳道加入约0.2卩L放射性标记的PCR产物。凝胶在0.6xTBE缓冲液中在1800-2000V(60A)条件下电泳两小时。过夜曝光后得到自显影图像。结果与讨论:在大量实验的基础上,如Figure1所示设计出了多重PCR的标准方法,其中也包括了许多经常遇到的问题的解决方案。为了便于使用,用斜体字将步骤表与材料和方法中的各点及以下部分联系起来。Muftip^)r pp*rv»oiB*1T*.W*戸Er・ww!-wt
温馨提示
- 1. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
- 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等,如果需要附件,请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
- 3. 本站RAR压缩包中若带图纸,网页内容里面会有图纸预览,若没有图纸预览就没有图纸。
- 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
- 5. 人人文库网仅提供信息存储空间,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑,并不能对任何下载内容负责。
- 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容,请与我们联系,我们立即纠正。
- 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。
最新文档
- 2024年度个人汽车抵押借款合同6篇
- 上海剧院(2024版)租赁合同2篇
- 2024年度公寓楼外墙清洗合同
- 2024年度广告发布合同:甲方委托乙方发布广告的具体内容和义务2篇
- 二零二四年度知识产权许可合同:某科技公司与另一科技公司之间的知识产权许可3篇
- 2024年国际艺术品展览与拍卖会合作合同
- 二零二四年度摄影棚设计建造合同2篇
- 2024医疗设备购销协议:高技术医疗设备买卖详细条款
- 2024年度标准中央空调设备销售协议版B版
- 2024年度建筑行业施工材料买卖协议范本版B版
- 东南亚文化学习通超星期末考试答案章节答案2024年
- 计算机软件著作权成果转化合同5篇
- 污水处理站升级改造技术方案
- 颌面骨骨折-颌骨骨折的诊疗(口腔颌面外科)
- 2024-2025学年上海中学高三下学期3月一模考试英语试题含解析
- 小学道德与法治《中华民族一家亲》完整版课件部编版
- 《“老字号”伴手礼》课件- 2024-2025学年岭南美版 (2024)初中美术七年级上册
- 日式手工纸产品市场环境与对策分析
- 2024年电大《学前教育学》考试题库及答案
- 产品材质渲染智慧树知到期末考试答案章节答案2024年浙江旅游职业学院
- 体检服务与健康档案管理制度
评论
0/150
提交评论