人白细胞蛋白质提取及双向电泳分析方法的初步研究

人白细胞蛋白质提取及双向电泳分析方法的初步研究

蛋白质组是指由细胞或组织的全部相应蛋白质组成的组。这一概念是由澳大利亚学者Wilkins和Williams于1994年提出,并最早见于1995年7月的“Electrophoresis”杂志上。蛋白质组学(proteomics)是以蛋白质组为研究对象,是在蛋白质多肽谱和基因产物图谱技术的基础上发展而来的,是在动态水平上通过对蛋白质进行测定,来阐述环境、疾病、药物等对细胞代谢的影响,并分析其主要作用机理,解释基因表达的主要形式。而双向电泳技术(Two-dimensionalelectrophoresis,2-DE)是蛋白质组学研究中的关键技术,目前已经广泛应用于多种正常和肿瘤组织蛋白质图谱的建立和特异性标志物的筛选研究。白细胞(包括中性粒细胞、酸性粒细胞、碱性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞)作为机体的特异性、非特异性免疫反应以及变态反应的主要细胞,关于它的基础和临床方面的研究很多,但对其进行蛋白质组方面的研究工作尚未见公开报道,本研究建立了人白细胞蛋白质提取及双向电泳的方法,为构建白细胞在不同生理或病理条件下的蛋白质表达谱或进行蛋白质表达的差异分析奠定基础。1试剂和仪器丙烯酰胺、N,N-甲叉双丙烯酰胺、尿素、十二烷基磺酸钠(SDS)、二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、过硫酸铵、CHAPS、TBP、线性固相pH梯度预制胶条(pH4～7)、矿物油均购自Bio-Rad公司;DMEM购自GIBCO公司;新生小牛血清购自成都市华星生物化学制品厂;Dextron-T500购自Pharmacia公司;考马斯亮兰G-250、考马斯亮兰R-250购自sigma公司;其余试剂为国产分析纯。1.2溶液配制11细胞分解溶液8M尿素,1%TBP,4%CHAPS,0.2%Bio-lyte,-20℃保存。2样品水化剂8M尿素,1%DTT,4%CHAPS,0.5%Bio-lyte,-20℃保存。3sds/甘油溶液6M尿素,0.375MTris(pH8.8),2%SDS,20%甘油,-20℃保存。平衡缓冲液应用液a:临用前加2%DTT。平衡缓冲液应用液b:临用前加2.5%碘乙酰胺。41固染料测试溶液10%冰乙酸,40%乙醇,10%甲醇。5染色溶液10%冰乙酸,40%乙醇,10%甲醇,0.25%考马斯亮兰R-250(W/V)。6仪器和检测方法7%冰乙酸,5%甲醇1.2仪器主要设备包括5417R高速离心机(德国Eppendorf公司),PROTEINIEFcell,PROTEINⅡXI2-DCell,GelAirDryingSystem,1022PLUS双向凝胶电泳系统(美国BIO-RAD公司),UV-1100紫外-可见分光光度计(北京瑞利分析仪器有限公司)。2实验方法2.1分离细胞ron取外周血25ml,加入等量3%Dextron,缓慢颠倒混匀,室温静置30min,取上层液体(内含白细胞),加适量PBS洗涤2～3次,1300转/分离心收集细胞。2.2冻融法提取细胞蛋白在收集的白细胞中加入5倍体积的细胞裂解液,反复吹打并于-80℃反复冻融3次,12000转/分离心60min,上清液即为白细胞蛋白裂解液,用考马斯亮兰G-250法测得蛋白样品浓度,-70℃保存备用。2.3ipg胶条电泳根据所测样品浓度取上述样品500μg加入水化缓冲液至总体积350μl,转移到水化槽中。取预先平衡至室温的IPG胶条一条,胶面向下放入水化槽,表面加矿物油覆盖,20℃水化过夜。然后将水化溶胀的IPG胶条转移入一向等电聚焦电泳槽中按下述步骤进行电泳:0～250V,30min;1000V,1h;1000～10000V,5h;10000V,6h;500V,20min,电泳总伏时数为88367。2.42向sds-gas2.4.1含碘乙酰胺的平衡缓冲液的t电泳完毕后取出胶条胶面向上置于含DTT的平衡缓冲液中平衡15min,然后再置于含碘乙酰胺的平衡缓冲液中平衡15min,取出后吸去胶条表面多余的液体。2.4.2凝胶的二维实验将平衡好的胶条以胶条背面紧贴玻璃板的方式放入预先制备好的SDS凝胶中,胶条下部紧贴凝胶上表面,再加入0.5%的琼脂糖凝胶封闭空隙,加入电极缓冲液,进行二向电泳。10mA电泳15min后加大电流至20mA直至溴酚蓝前沿距离玻璃板下缘0.5cm时停止电泳。2.5决定的颜色和保存取出凝胶,按文献所述方法用考马斯亮蓝R-250染色,染色完毕后,用玻璃纸覆盖凝胶,放入干胶仪中干胶,并照相保存结果。3结果3.1全细胞蛋白双向电泳以pH4～7的IPG胶条为一向进行等电聚焦,以SDS作为二向进行垂直电泳,按上述步骤对白细胞裂解蛋白进行电泳,最后用考马斯亮蓝R-250染色得到的全白细胞蛋白双向电泳图谱,见附图。4后基因组中白领的检测白细胞是机体的主要免疫细胞,主要参与机体的各种特异性、非特异性免疫以及变态反应,白细胞功能异常可以引起多种自身免疫性疾病,而白细胞的恶变可导致各种白细胞性白血病,因此长期以来人们就运用多种方法对白细胞进行研究。随着后基因组时代的到来,可以运用蛋白质组学的研究技术来进行白细胞的研究,而首要任务就是建立一种有效的白细胞蛋白提取和双向电泳方法。本实验以pH4-7的IPG胶条为一向进行等电聚焦,以SDS作为二向进行垂直电泳,对白细胞裂解蛋白进行电泳,然后用考马斯亮蓝R-250染色得到较为满意的全白细胞蛋白双向电泳图谱,并用PDQuest2D分析软件和SWISSSPORT蛋白质数据库对该图谱进行了初步分析,具体讨论如下。4.1选择糖溶解度及影响等电聚焦的杂质在双向电泳中样品处理的好坏会影响到最终实验结果的分辨率及重复性,是双向电泳成功的关键步骤。样品的处理要在尽量提高蛋白溶解度的基础上,减少各种可能影响等电聚焦的盐离子、核酸等杂质。因此,我们采用密度梯度离心的方法分离白细胞,并用反复冻融法使白细胞裂解,这样就减少了其它干扰等电聚焦的因素影响。此外在提高蛋白质溶解性方面,用三正丁基膦(TBP)代替常规方法所用的DTT,可大大提高蛋白质溶解度并促进蛋白质从第一向到第二向的转移,取得了良好的效果。4.2ipg胶条电泳传统的一向等电聚焦是用载体两性电解质为基础的圆盘电泳来进行,但存在较多缺陷,包括:载体两性电解质形成的pH梯度较窄且不连续,存在阴极漂移现象,因两性电解质的生产批次不同而影响实验的重复性等缺点。在本实验中我们采用的是固定干胶条技术(IPG技术)。运用IPG技术进行一向电泳,操作简便,并且避免了传统的以载体两性电解质为基础的等电聚焦带来的缺陷,而且IPG胶条有不同的长度和pH范围,可以根据具体的分离要求选取不同型号的胶条。在预实验中我们发现白细胞蛋白的pI大多在pH5～7的范围内,因此我们选用pH4～7长17cm的IPG胶条进行一向电泳,可以提高电泳分析的分辨率。本实验中样品的水化采用被动水化的方式,并以250V低电压电泳30分钟,可以除去胶条中的盐离子,然后逐渐升高电压,电泳总伏时数达到60000VH以上即可达到充分聚焦的目的。4.3向sds杂志通过对不同实验条件的筛选,本实验采用分离胶浓度10%,Tris-甘氨酸缓冲系统,在20℃,20mA电流进行电泳取得了较好的分离效果。4.4核心细胞系统的染色电泳完毕之后,根据不同的上样量和不同实验所要求的分辨率,可以选用不同的染色方法进行染色,常用的染色方法有:考马斯亮蓝(coomassiebrilliantblue,CCB-250)染色,银染法,以及SYPRORUBBY染色法。本实验因为是对白细胞蛋白作一常规的双向电泳分析,故采用考马斯亮蓝染色法进行染色,同样取得了理想的染色效果。染色完毕后的凝胶,经干胶仪干胶后可长期保存。为了进行进一步的痕量蛋白的分析,在后续实验中我们还将进行银染法染色,以获得更多点和分辨率更高的白细胞蛋白质双向电泳图谱。4.5纤维初始鉴定获得的电泳图谱可运用ImageMaster2D和PDQuest等软进行分析处理,对于不同的蛋白质斑点可根据其pI和MW通过SWISSSPORT蛋白质数据库进行初步鉴定,对感兴趣的点可应用Westernblotting、质谱甚至氨基酸序列分析等方法进行进一步的鉴定。综上所述,本实验建立了人白细胞蛋白质的双向电泳分析方法,并对电泳图谱进行了初步分析。整块胶染色效果好、本底浅,各点分离清晰,无明显横向或纵向拖尾,能满足2-DE专业软件分析的要求,为