齿突蟾属4物种皮肤组织形态学结构研究

齿突蟾属4物种皮肤组织形态学结构研究

皮肤作为两栖动物和栖息地环境直接接触的器官，在进化过程中形成了身体和环境之间的第一个天然屏障，具有防御、呼吸、舒适度、繁殖、调节和其他功能。皮肤腺体包括颗粒腺和粘液腺,能够抵御病原微生物入侵、调节渗透压、维持体内环境的稳定,两栖类皮肤在维持机体生存、适应栖息地及复杂的生态环境中起着重要的作用(Toledo&Jared,1995;Zugetal.,2001)。对我国两栖动物皮肤的组织学观察已在部分有尾类(杜春华,1992;吴淑辉,吕九全,1994;陆宇燕,李丕鹏,1999;唐以杰等,1999;刘炯宇,2004;陆宇燕等,2004;陈贵英等,2005;徐剑,2007)和无尾类(耿欣莲,1959;张贤芳等,2002;梁刚,王琼霞,2004;刘满樱等,2007;林文达等,2008;林文达,朱静,2009)中展开,这些研究显现出皮肤形态结构与机体生态适应功能紧密联系,如以下2个方面:(1)水栖性强的物种,如大鲵Andriasdavidianus、山溪鲵Batrachuperuspinchonii等,皮肤光滑,表皮角化程度低,毛细血管丰富,皮肤在呼吸中占有重要地位;陆栖性较强的物种,如爪鲵Onychodactylusficsheri、中华蟾蜍Bufogargarizans等,皮肤表皮角化程度高,能有效防止水分的散失。(2)皮肤在不同的季节略有变化,这些变化与能量吸收、繁殖相关联,如东北林蛙Ranadybowskii、隆肛蛙Feiranaquadrana疏松层内黑色素细胞在不同季节排列分布有改变,又如多疣狭口蛙Kaloulaverrucosa在繁殖期粘液腺会增多。齿突蟾属Scutiger隶属两栖纲Amphibia无尾目Anura角蟾科Megophryidae,可分为2个亚属:以陆栖为主的齿突蟾亚属S.(Scutiger)Theobald,1868和以水栖为主的猫眼蟾亚属S.(Aelurophryne)Boulenger,1919。本属物种皮肤较粗糙,头骨一般宽大于长,上颌无齿或有小齿突,或个别种齿较明显(费梁等,2009)。齿突蟾属物种主要分布于中国的西部高原,低温、高海拔、强紫外辐射是其生境的重要特点,物种为适应这种极端环境,机体必然有相应的适应策略。皮肤作为机体与环境接触的第一道屏障,在生态适应中可能起着重要的作用,是研究这种生态适应的理想材料。本文以西藏齿突蟾S.(S.)boulengeri、刺胸猫眼蟾S.(A.)mammatus、木里猫眼蟾S.(A.)muliensis和胸腺猫眼蟾S.(A.)glandulatus为代表,从组织学水平初步观察了不同部位皮肤的形态结构特点,旨在丰富两栖类的形态学内容及比较组织学的基础资料,并探讨两栖动物皮肤结构与环境适应的关系。1材料和方法1.1动物材料实验用西藏齿突蟾、刺胸猫眼蟾、木里猫眼蟾和胸腺猫眼蟾各3只,标本详细信息见表1。1.2皮肤组织结构观察标本保存于10%福尔马林,每个标本体背和体腹各取皮肤样品约1cm×1cm,常规石蜡包埋切片法制作组织切片(王晓东,汤乐民,2007)。长期保存于10%福尔马林中的已经固定标本,皮肤取样后流水冲洗48h,转入70%酒精。逐级浓度酒精脱水,二甲苯透明,石蜡包埋。切片厚度6~8μm,HE染色,中性树胶封片。LeicaDMRA2显微镜观察并摄像,目镜测微尺结合软件ImageJND2测量。每块皮肤均匀取5个位点分别测量表皮层数、表皮厚度、疏松层厚度、致密层厚度及皮肤总厚度数据。记录皮肤样品切面上1cm长的皮肤所含粘液腺和颗粒腺的数量及其长短径,具体方法为显微镜观察计数粘液腺和颗粒腺,长短径通过目镜测微尺测量。皮肤切面为直线的,直接用目镜测微尺测量其长度;若皮肤切面为弯曲状,以相同放大倍数下台镜测微尺为标尺,结合软件ImageJND2测量照片上的皮肤长度。一般皮肤切片长度约为1cm,统计每条皮肤切片具体的长度,按比例将本条切片中粘液腺和颗粒腺的数量折合成1cm长度下的数量。Excel2003数据录入,SPSS17.0进行T检验,以0.05作为差异显著性的判断标准,所有数据都以均值±标准误的形式表示,由于样品有限,未考虑性别差异。2结果2.1从淋巴中分离齿突蟾属皮肤与已报道两栖动物皮肤结构基本相同,分为表皮和真皮两部分(封3,图1)。皮肤腺体包括粘液腺和颗粒腺两种,皮下有大的淋巴间隙,易与其下的组织剥离。在齿突蟾属4个物种的体背、体腹皮肤真皮疏松层中,发现一种HE染色呈蓝色条带的特殊物质,如图1红色箭头所指为钙化层(laminacalcarea),是皮肤内骨骼(integumentaryskeletion)的一种。2.1.1层细胞的发育表皮为复层上皮,含多层细胞,从外向内分为角质层、颗粒层、棘细胞层和生发层。角质层由角化的扁平细胞组成,细胞角化均匀,并与颗粒层细胞区分明显。西藏齿突蟾表皮角质层有1~2层细胞,刺胸猫眼蟾、木里齿突蟾和胸腺猫眼蟾表皮角质层只有1层细胞。颗粒层有1~2层细胞,腹部颗粒层较背部明显,呈圆形、椭圆形或梭形,颗粒层向外推移,角化形成角质层。棘细胞层有2~3层细胞,背部细胞核多为椭圆形或梭形,腹部多为圆形或椭圆形。棘细胞向外推移,细胞由大的多边形逐渐变小,细胞核由长椭圆形渐变为小椭圆形,形成颗粒层。生发层位于表皮最内层,有1层细胞。背部细胞呈椭圆形,核大,椭圆形;腹部生发层呈立方柱形,排列紧密整齐,核长椭圆形。生发层细胞为表皮干细胞,不断产生新的细胞向外层推移,逐渐分化为各层细胞。2.1.2皮肤组织病理学观察真皮层位于表皮下,较表皮厚,含有丰富的细胞类型和结构,分为内外两层,外层为疏松层或海绵层,内层为致密层。疏松层紧贴在表皮生发层下面,分布有大量色素细胞、纤维、神经、血管及腺体。皮肤毛细血管分布于表皮与真皮的相接处,并与表皮平行排列成一排。西藏齿突蟾皮肤毛细血管数量相对较少,木里猫眼蟾较多,刺胸猫眼蟾和胸腺猫眼蟾毛细血管分布最多,并凸入表皮。色素细胞HE染色条件下棕黑色,细胞形状不规则,很多分支交织形成色素层,主要分布在疏松层最外层,也散布于致密层,此外4物种的体背表皮中也可见少量的黑色素细胞。齿突蟾属4物种背部色素层都非常发达,腹部的色素层也较发达。真皮致密层由排列紧密的胶原纤维呈平行波浪状交织而成,并有垂直排列的纤维束伸至表皮基底。在HE染色条件下,致密层呈淡粉色,整体颜色较疏松层要深。2.1.3皮质he染色皮肤腺体有两种,即粘液腺和颗粒腺,位于真皮疏松层。两种腺体均为多细胞腺体,由分泌部和导管组成,多个腺上皮组成分泌部,并向下凹陷于真皮疏松层内,呈球状结构;导管由柱状上皮细胞组成,与表皮细胞相连,开口于体表。粘液腺个体较小,周身体表都有分布,上皮细胞呈立方形,分泌部中空,HE染色呈淡蓝色。颗粒腺个体较大,上皮细胞间无明显的界限,HE染色有红色颗粒,主要分布于体背。皮下层位于真皮之下,主要由疏松结缔组织、淋巴间隙及血管构成。此层与真皮交界处有发达的淋巴间隙,使皮肤易与其下的组织分离。2.2突浚体表皮厚度差异齿突蟾属背部和腹部表皮细胞层数、皮肤厚度均有差异(表2),4物种背部表皮层数比腹部少,胸腺猫眼蟾体腹表皮最厚。统计学分析表明,西藏齿突蟾的体背、体腹表皮厚度差异显著(P<0.05),木里猫眼蟾与胸腺猫眼蟾体背、体腹表皮厚度差异极显著(P<0.01)。西藏齿突蟾体背疏松层厚于致密层(P<0.05);猫眼蟾亚属3物种中,同一物种的真皮疏松层体背比体腹厚(P<0.01),体背疏松层比致密层厚(P<0.01)。皮肤整体厚度,刺胸猫眼蟾与胸腺猫眼蟾体背厚于体腹(P<0.05);西藏齿突蟾与木里猫眼蟾体背厚度均值也大于体腹,但差异不显著。2.3皮肤组织中的密度粘液腺的外形比颗粒腺小,数量则较颗粒腺多,周身体表都有分布,统计每块皮肤1cm长切片内所含粘液腺的数量及其长短径(表3)。颗粒腺多分布于背部,仅在木里猫眼蟾和胸腺猫眼蟾的体腹各发现一个颗粒腺,且个体较小。每块皮肤统计1cm长切片内所含颗粒腺的数量及其长短径(表4)。3讨论3.1齿突浚属植物的皮肤显微观察两栖类属于水陆间的过渡类型,为适应陆地生活防止体内水分大量散失,表皮开始角质化。西藏齿突蟾、刺胸猫眼蟾、木里猫眼蟾和胸腺猫眼蟾一般栖息于中小型山溪的石头间隙内,或在河边缓流处石下,所在环境一般植被稀少,大小卵石甚多。成体白天栖息在溪内或溪边的石头下,夜间外出捕食。齿突蟾亚属体型窄长,陆栖性较猫眼蟾亚属强,猫眼蟾亚属体型肥硕,一般不远离水源活动,行动迟缓(费梁等,2009)。比较齿突蟾属2亚属4个物种的皮肤显微结构发现,西藏齿突蟾表皮角质化程度稍高于其它3个物种,表皮角质层有1~2层细胞,其它3个猫眼蟾亚属物种只有1层。这可能与齿突蟾亚属物种陆栖性较猫眼蟾亚属强有关,陆栖性强则更需防止水分的散失,表皮层角质化程度稍高是其皮肤结构对生活环境的适应。但与皮肤表皮角化可达3层(耿欣莲,1959)的陆栖性更强的蟾蜍类相比,齿突蟾亚属的陆栖性也只是稍强,因此其生活环境只能局限在水体附近。一般认为表皮角化程度低,毛细血管丰富是水栖性较强的物种皮肤结构的重要特征,这说明皮肤在呼吸中占有重要地位,这些特征在大鲵(吴翠蘅,高武,1983)、商城肥鲵(吴淑辉,吕九全,1994)、爪鲵(陆宇燕等,2004)以及隆肛蛙(梁刚,王琼霞,2004)的皮肤显微观察中均有报道。本研究发现毛细血管在齿突蟾属皮肤浅表层的排列分布,尤其在猫眼蟾亚属较明显,毛细血管数量多且凸入表皮,说明了该类群物种皮肤呼吸的重要性。皮肤厚度数据表明,齿突蟾属物种体腹表皮层数比体背多,厚度也比体背厚,这与其营陆栖生活爬行运动中腹面皮肤的抗磨损保护有关。皮肤整体厚度在4个物种中都是体背厚于体腹,这与已报道的东北林蛙和中华蟾蜍躯干背侧皮肤厚于腹侧相吻合(张贤芳等,2002;刘满樱等,2007)。体背疏松层里含有较多的颗粒腺与粘液腺,结缔组织在体背分布更发达,发达的结缔组织交织成网,增强了背侧皮肤的弹性和韧力,更加能适应环境。3.2皮肤屏障的作用齿突蟾属物种主要分布于中国的西部高原,低温、高海拔、强辐射是其生活环境的显著特点。皮肤组织学观察发现,齿突蟾属物种体背的色素层非常发达,体腹也有较发达的色素层。一般认为,两栖动物皮肤中分布的色素细胞,在光线和温度的影响下,可通过扩展、聚拢的形态变化,引起体色改变,形成保护色或警戒色(Hunsaker&Johnson,1959)。色素层发达,皮肤颜色加深,有助于齿突蟾属物种从外界环境吸收较多热量,满足自身新陈代谢的需要。黑色素细胞与抵抗紫外辐射的关系,在人的皮肤上研究得较多,黑色素细胞能有效减少紫外线对机体的伤害(Kaidbeyetal.,1979)。针对两栖动物全球性衰退的现象,不少学者在研究紫外辐射与两栖动物的衰退的关系时,发现紫外辐射会导致两栖动物的胚胎畸形,降低幼体的成活率,同时也发现高海拔分布的两栖动物(如欧洲林蛙Ranatemporaria),幼体或成体皮肤里的色素细胞,包括黑色素细胞,能有效防止紫外辐射的伤害(Hofer&Mokri,2000;Blaustein&Belden,2003)。由此推测,高海拔地区生活的齿突蟾属物种,皮肤内发达的色素层,尤其是在体腹的广泛分布,正是对其生活环境中强紫外辐射的适应。3.3皮肤内骨骼和皮肤教育的研究本实验在齿突蟾属4个物种的体背、体腹真皮疏松层里发现的特殊物质,HE染色呈蓝色条带,看不出细胞结构,位于色素层的下方,初步认为是钙化层(laminacalcarea)。皮肤钙化层属于皮肤内骨骼,其发育机制至今还没有很好的解释,有假说认为是由成纤维细胞矿化形成,没有细胞结构,为非胶原机质,含有多糖蛋白(包括糖聚胺糖)以及羟基磷灰石状晶体(Vickaryous&Sire,2009)。Vickaryous和Sire(2009)总结了四足类皮肤中的皮肤内骨骼(integumentaryskeletion),无尾两栖类中皮肤内骨骼包括皮肤骨化(osteoderm)和皮肤钙化层(laminacalcarea)两种。在双色叶泡蛙Phyllomedusabicolor有皮肤骨化的报道(Vickaryous&Sire,2009),在海蟾蜍Bufomarinus(Tol