基于基因表达的啤酒酿造品种遗传连锁图谱研究

基于基因表达的啤酒酿造品种遗传连锁图谱研究

啤酒生产是生物技术中最古老的应用形式之一。随着现代生物技术的发展，啤酒行业经历了重大变化，尤其是近年来的分段子生物技术在啤酒生产原料的鉴定和改进、啤酒酵母菌的鉴定、育种和代谢控制以及啤酒发酵中污染各种细菌的鉴定、栽培和代谢的应用，以及对啤酒质量和啤酒口感的改善和缩短发酵周期。提高发酵效率，节约投资，促进啤酒行业的发展。1啤酒制造原料的鉴定和改进1.1天麻天麻大颗粒及相关基因的扩增大麦是生产啤酒的主要原料,其质量品质直接影响到麦芽制作,啤酒酿造过程和成品啤酒的质量。而只有纯品质优的啤酒大麦才能通过制麦工艺生产出优质的麦芽,因此有效地鉴定和改良大麦品种是非常重要的。传统的鉴定方法是通过麦粒的外观形状、生理生化指标以及其在微型制麦中发芽品质来鉴定,此法耗时长,重复性差,往往得不到满意的结果。随着分子生物技术的应用,这一问题能得到较好解决。Gebre等学者研究认为根据大麦中特定的醇溶蛋白结合模式将40种大麦品种分成17组,最为有效的分类体系是用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)将353种大麦品种根据其B型和C型醇溶蛋白的位置加以区分。Huston等研究者发现在凝胶上用特殊的酯酶染色可以看到同工酶的不同而反应酿造大麦品种的清晰差别。Black等采用等电聚焦研究了三种可区分的蛋白质组分,根据醇溶蛋白结合模式、球蛋白和过氧化物同工酶成功地区分了21种大麦。尽管这些手段在大麦品种鉴定上都是有效的,但尚不能够鉴定一个混合样品中所有可能的品种。北美大麦基因组图谱计划(NABGMP)采用限制性片段长度多态性(RFLP)标志的方法构建了大麦的遗传连锁图,分析确定了具有好几百个分子标记的相关联图谱。它的优点在于能直接发现同源染色体上核苷酸碱基序列的差异,与传统的形态学和生物化学标志不同的是RFLP分析与基因表达无关,且检测容易、便于实现自动化。Blake等设计了115对顺序标记位点的多聚酶链式反应(STS-PCR)引物,可以通过这些引物直接PCR扩增可以获得大麦品种特异性的指纹图谱(fingerprinting),该技术是啤酒大麦纯度测定的一种适用技术。运用该技术Chee等研究者选择了14种制麦和酿造工业所用的重要大麦品种并将每一品种准确地鉴定出来。Ko等研究者用来自于大麦α-淀粉酶基因引物,通过PCR成功地鉴定了形态上相似的制麦大麦。与此同时,Araki等采用随机扩增多态性(RADP)和扩增片段长度多态性(AFLP)DNA标记技术成功地建立了11个品种的酒花基因指纹库。对于未知品种的酒花只需提取其任一部分的DNA进行PCR扩增便能在两天内鉴定出其品种来。1.2可减少麦芽发酵过程中-淀粉酶活性的基因分子标记也被用来辅助大麦育种,在用分子标记确定适合酿造蒸馏酒的大麦研究中,通过分子标记对大麦第五染色体作图,在育种程序中使用分子标记选用最适合于蒸馏酒的大麦,其可能的机制是:与发酵能力相关的两个基因绘图到基因组区域,从而影响了β-淀粉酶活性,最终影响发酵能力。在补充麦芽酶谱提高大麦麦芽质量的研究中,编码耐热真菌末端-1,4-β-葡聚糖酶(EGI)的基因被引入两个大麦品种,基因在种子萌发期间表达,糖化后产生具有活性的耐热酶。由于由大麦产生的异源EGI缺少纤维素结合区域以及糖化底物是可溶性β-葡聚糖,它的实际应用和糖化不会受到影响。实际证明,由这些种子产生的耐热β-葡聚糖酶的数量有能力通过降低可溶性β-葡聚糖含量而降低麦汁的粘度。2葡萄糖母的分类、鉴定和改进2.1菌株鉴定及pcr检测传统的酵母菌鉴定主要是根据其微观形态特征及其生理生化特点建立起来的,由于酵母的表型特征较为复杂,使得鉴定工作困难。利用分子生物技术从遗传本质上对其进行分类鉴定,使鉴定更为准确、可靠。目前利用核酸杂交技术研究真菌DNA分子中碱基序列的同源程度,以此来表明同一属内各种间和属内亲缘关系的远近。Horgen和Vilgalys等研究结果表明在真菌中,用整个基因组进行杂交,除近似种外,其余的序列同源性都较低。Vanghan等将这一项研究应用于对酵母菌的鉴定中,发现啤酒酵母、贝酵母、薛瓦酵母、意大利酵母、葡萄汁酵母的DNA-DNA重结合表现出90%的碱基序列是相同的,所以他们认为后4个种应该归并为啤酒酵母。利用电泳核型(EK)分析真菌的染色体数目及基因组测定、基因的杂交定位及基因作图方面已得到了较满意的应用,利用该技术得到的核型图谱已广泛应用于酵母的分类研究中。Carle等应用这项技术在啤酒酵母中建立了电泳核型指纹图谱。Schwartz等应用脉冲电泳成功地分离了酵母的染色体DNA,并以建立了标准的酵母核型指纹图谱。此外,其它几种基于PCR和分子杂交技术的DNA标记方法如限制性片断长度多态性技术(RFLP);微卫星DNA指纹图谱分析技术;随机扩增多态性DNA(RAPD);扩增片段长度多态性技术(AFLP)在酵母分类鉴定研究方面也有较多的成功报道。分子标记技术对酵母的鉴定有助于我们加深对形态学性状进化的认识,同时表型特征也可以用来验证某一分子性状对酵母的分类价值。2.2改进的啤酒生产特性2.2.1减少-葡聚糖酶的活性尽管啤酒的原料大麦中含有一定量的β-葡聚糖酶,但在制麦和糖化中几乎全部被破坏而失去活性。而通常使用的啤酒酵母不能利用β-葡聚糖。残留的β-葡聚糖除了引起啤酒过滤困难外还影响啤酒的风味和质量。通常的解决方法是添加一定量的β-葡聚糖酶。William等将Bacillussubtilis的β-葡聚糖酶基因克隆于MFal启动子和分泌信号序列下游,转化啤酒酵母获得的转化子能产生具有活性的β-葡聚糖酶,其中85%可以从酵母细胞中分泌出来,但是由于麦汁的PH值相对较低,从而导致产生的β-葡聚糖酶在发酵中水解β-葡聚糖的活力很低。随后Penttila等克隆了Trichodermareesei中编码内切β-1,4-葡聚糖酶的基因EG1I。将EG1I插入到酵母载体的磷酸甘油激酶基因(PGK)启动子和终止序列之间,采用整合质粒转化啤酒酵母。所得转化子可以有效地降低麦汁中的β-葡聚糖含量,加快啤酒的过滤速度而没有改变啤酒的感官风味和酵母原有的发酵性能。2.2.2低糖发酵的啤酒啤酒酵母一般只能利用单糖,双糖及三糖,而不能利用约占麦汁总糖25%的多糖和糊精。成品啤酒中含有这些糖类物质不利于肥胖人群和糖尿病人饮用。通过基因工程技术的改造能使酵母具有产生淀粉葡萄糖苷酶(AMG)或α-淀粉酶的能力,降解了麦芽四糖、糊精和淀粉,减少了成品啤酒中的糖分,生产出低糖低热能的啤酒。William等将小麦的α-淀粉酶基因导入啤酒酵母中构建工程菌,实验室规模的发酵试验证明,含α-淀粉酶基因的工程菌的发酵能力较亲株有明显的提高。在史文慧等对酵母菌产乙醇的研究中,通过乙酸锂转化的方法将adh2基因成功导入酵母菌株,经抗性筛选,得到adh2基因突变的杂交双倍菌株,再由突变的杂合双倍体菌株,通过四分体剖分获得了一株adh2基因被删除的突变单倍体菌株,经过发酵实验,发现adh2基因被删除的突变单倍体菌株不利用乙醇。这株adh2基因被删除的突变单倍体菌,由于其突变发生在染色体水平上,因而遗传稳定,在发酵中无需添加其它物质以保证其存在优势,而且在发酵后期不能利用乙醇作碳源,从而减少了乙醇的消耗因而在生产中有一定的意义。2.2.3啤酒双乙酰发酵试验双乙酰是影响啤酒风味的重要成分,其含量(包括其前体α-乙酰乳酸)的多少,是啤酒口味成熟度的重要指标,加速啤酒的成熟即缩短后发酵的主要措施就是要除去双乙酰。双乙酰是由啤酒酵母细胞体内所进行的缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸生物合成的中间产物α-乙酰乳酸分泌到细胞体外时,由非酶促的氧化脱羧反应自发产生的。利用基因工程策略增强α—乙酰乳酸脱羧酶的活性,提高缬氨酸生物合成以后的酶活,使α-乙酰乳酸在未转化为双乙酰之前就被迅速转化为其他物质是较好的降低啤酒双乙酰含量的思路。α-乙酰乳酸脱羧酶在啤酒酵母中不存在,而在细菌中普遍存在。Sone等克隆了E.aerogenes的α-乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)基因在啤酒酵母中表达,结果证明转化子的每毫克蛋白有2~3个α—乙酰乳酸脱羧酶活力单位,转化子所生产的嫩啤酒中双乙酰含量很低。Fujii等将E.aerogenes的ALDC基因克隆到酵母整合质粒(YIP)上,通过转化将其整合到酵母的染色体上,得到含有20个以上ALDC基因拷贝的转化子,转化株的ALDC基因在非选择条件下稳定。发酵试验表明转化子在主酵后的双乙酰含量比亲株低50%以上,而酵母的生长速度和乙醇的生成能力都没有受到影响。Yamana等比较了乙醇脱氢酶(ADH1)、磷酸甘油酸激酶(PGK)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPD)启动子对ALDC基因在啤酒酵母中表达所起的作用,实验表明在发酵条件下含有PGK启动子的ALDC基因在酵母中表达水平最高,说明PGK启动子是ALDC基因在啤酒中高效表达的最强启动子。2.2.4异源多倍体啤酒酵母菌在检测亚硫酸盐和生物合成途径方面的应用亚硫酸盐是啤酒酵母硫代谢的中间产物,能与啤酒中主要的老化物质羰基化合物通过复杂的反应生成对风味稳定性无影响的较稳定的复合物,能够延长啤酒风味的保鲜期。对啤酒酵母中含硫氨基酸的硫吸收和生物合成途径的研究表明缺失编码高丝氨酸邻乙酰转移酶(MET2)基因的酵母菌不能产生邻乙酰高丝氨酸,从而不能对亚硫酸盐的形成起阻遏作用,这样缺失MET2基因的突变株中就能大量形成亚硫酸盐。Hansen等用异源多倍体啤酒酵母为出发菌株,以G418抗性作为筛选重组子的标记,构建了缺失3或4个MET2拷贝或者是缺失3或4个MET10拷贝的异源多倍体酵母工程菌。发酵实验证明这些重组子其它各方面性能指标均较好,但发酵速度过慢。目前丹麦嘉士伯实验室也正在进行这方面的研究。2.2.5用木聚糖酶基因作酰氯及酵母基因型菌株的构建发酵生产啤酒后的酵母细胞是啤酒生产重要的副产物,每生产100t啤酒就可得到含水分75%~80%的剩余酵母泥1.5t。这些酵母一般直接收集经干燥后得到酵母粉,作为动物饲料,利用价值不高。通过基因工程技术可以进一步提高啤酒废酵母的商业价值,即通过转入异源基因,在发酵结束以后使酵母能够生产有价值的异源蛋白质和糖类化合物。在这方面现在进行的研究是将木聚糖酶基因导入啤酒,木聚糖是由β-D-1,4-木糖苷键连接起来并带有多种取代基的多聚糖,是一种巨大的生物资源,而木聚糖酶则是降解该物质的最主要酶之一。Donaldo等将厌氧菌的耐热木聚糖酶基因通过酵母载体pFLAGU2导入到啤酒酵母中,从而使该酵母在生长过程中能够分泌木聚糖酶。Hinchliffe等将高价值的人血清白蛋白的基因克隆到啤酒酵母中,使其能够调控表达。当啤酒酵母进行啤酒的生产发酵时,酵母所携带的人血清白蛋白的基因不表达,而当啤酒生产结束后,将酵母转入含有诱导剂-乳糖的培养基中,人血清白蛋白的基因开始表达,产生大量的胞内人血清白蛋白。更重要的是,转化子与亲株相比,发酵能力相似,所生产的啤酒风味上也没有改变。此外,为了适应多样的消费群体和使啤酒酿造技术更为合理,便于控制,有关研究者进行了不同特色的酵母工程菌的研究,如构建产无醇啤酒的啤酒酵母菌株,抗污染的啤酒酵母菌株,耐高渗透压的啤酒酵母菌株等。但是啤酒是直接供给人们消费的食品,在使用基因工程技术改良菌种的时候应尽量使用食品级微生物的基因或啤酒生产所用的原料的基因。3啤酒杂菌的检测在啤酒酿造中通常采用两种传统的方法检测杂菌:一是培养生长在啤酒中的微生物,这种方法虽然可以较为准确地测量杂菌,但时间较长对生产指导具有延缓性。二是通过分类学鉴定检测杂菌,这种方法虽然快速,但难以预测被检测到菌造成啤酒酸败的能力。聚合酶链式反应(PCR)技术为检测啤酒杂菌提供了新的快捷方法,此方法快速灵敏,不需要微生物培养和分类学鉴定。目前美国、日本及我国的研究者都在致力这方面的研究,主要采用了三种技术:使用特异性引物的PCR技术,一些乳酸菌,尤其是Lactobacillus属能对酒花中异α酸产生抗体,在啤酒中生长时引起啤酒酸败给酿造工业带来严重的问题。据研究能在啤酒中生长的具有酒花抗性Lactobacillus一般都带有与酒花抗性有关的类horA基因,根据horA基因地编码序列设计PCR引物,通过PCR扩增就能预测出存在啤酒当中的任一种Lactobacillus。使用嵌套多聚酶链式反应可以减少酵母细胞存在产生的干扰。随机扩增多态DNA(RAPD)技术在啤酒杂菌检测中也较为常用,研究者使用寡聚核苷酸引物对微生物的16rRNA基因进行PCR扩增和比较,能够鉴别出啤酒腐败菌的属种。。基因组简单重复序列PCR是近几年发展起来的DNA标记技术可以用于检测啤酒发酵中的杂菌污染即首先要设计特异性的引物,然后通过PCR反应扩增细菌DNA重复元件如ERIC,BOX或者(GTG)5等,该技术与RAPD技术具有相似之处,但