斑点酶免疫试验检验igg型rf和igm型rf的研究

斑点酶免疫试验检验igg型rf和igm型rf的研究

目前，临床检验室通常进行免疫凝胶囊泡试验（ila），以检测患者血清中的风湿因子（rc）。此法敏感度较差,检测结果的稳定性不太好,不能区别不同类型的RF,因此,临床检验室需要一种特异性强、敏感度高、稳定性好和能区别不同类型RF的检测方法。为此,本科研制了以变性兔IgG交联硝酸纤维素膜的斑点酶免疫试验(dot-EIA),用于检测病人血清中的IgG型RF和IgM型RF,并与ILA法比较,获得了较满意的结果。现将此法的研制和检测结果报道如下。1材料和方法1.1实验材料1.1.1血清检查本院门诊部检测RF血清100份。1.1.2阳性血清收集3名临床确诊为类风湿性关节炎并经ILA法10次检测均为RF阳性病人的血清,组成混合阳性血清。1.1.3阴性血清收集3名经ILA法10次检测均为RF阴性健康人的血清,组成混合阴性血清。1.1.4兔igg的制备上海科欣生物技术研究所生产,在有效期内使用。兔IgG参照文献自行制备的纯化兔IgG。HRP—羊抗人IgG和HRP—羊抗人IgM成都生物制品研究所生产。硝酸纤维素膜由浙江黄岩人民化工厂生产。1.1.5洗涤液、底物的配制稀释液为0.01mol/LpH7.2PBS,洗涤液为含0.05%吐温20的0.01mol/LpH7.2PBS,底物为OPD溶液(临用时按文献新鲜配制)。1.2实验方法1.2.1变兔igg的检测将纯化的兔IgG溶液置60℃水浴25分钟,使兔IgG变性。将变性兔IgG溶液用稀释液作1∶2、1∶4、1∶8、1∶16稀释后,各浓度液分别点滴于硝酸纤维素膜上,每点5μl,干燥后用化学方法将变性兔IgG交联在硝酸纤维素膜上,待干后,点滴10%小牛血清封闭,并用化学方法固定,干燥后,分点滴加混合阳性血清和混合阴性血清,置湿盒37℃2小时后用洗涤液漂洗,分别滴加1∶2稀释的HRP-羊抗人IgG和1∶2稀释的HRP-羊抗人IgM,置湿盒37℃30分钟后漂洗,加底物显色,显色后立刻轻轻漂洗。以阳性血清显棕黄色斑点和阴性血清不显色选出变性兔IgG溶液的工作浓度为1∶2稀释液。按照上述方法,将1∶2稀释的变性兔IgG交联在硝酸纤维素膜上,并用10%小牛血清封闭。分点滴加待检血清后置湿盒37℃2小时,然后漂洗,滴加1∶2稀释的HRP-羊抗人IgG或1∶2稀释的HRP—羊抗人IgM,置湿盒37℃30分钟后漂洗,加底物显然,显色后立刻轻轻漂洗,每份待检血清分别作3次检测,每次检测设混合阳性血清和混合阴性血清对照。在对照阳性血清显示棕黄色斑点而对照阴性血清不显色时,判读待检血清斑点的显色结果。每份待检血清3次检测有2次或3次显示棕黄色或浅黄色者判断为IgG型RF或IgM型RF阳性血清,2次或3次不显色者判断为IgG型RF或IgM型RF阴性血清。1.2.2阳性血清和阴性血清对照按照试剂盒说明书操作。每份待检血清作3次检测,并设阳性血清和阴性血清对照。每份待检血清3次检测有2次或3次凝集者判断为RF阳性血清,2次或3次不凝集者判断为RF阴性血清。2两组待检血清rf阳性检测率比较见表32.1100份待检血清经两种方法检测的结果从表1可以看出,dot-EIA法检测为RF阳性、ILA法检测也为RF阳性的血清有44份,两法检测均为RF阴性的血清有48份,因此,两法检测RF的符合率为92%(92/100)。有3份dot-EIA法检测IgM型RF为阳性的血清,ILA法检测RF为阴性,有5份前法检测IgG型RF为阳性的血清,后法检测为RF阴性。两法RF阳性检测符合率为84.62%(44/52)。2.2100份待检血清两种方法检测RF阳性结果比较从表2可以计算出,dot-EIA法的RF阳性检测率是52%(52/100),ILA法的RF阳性检测率是44%(44/100),前法RF阳性检测率高于后法(χ2=6.125,0.025>P>0.01)。dot-EIA法的IgG型RF阳性检测率为49%(49/100),IgM型RF阳性检测率为17%(17/100)。此法能较好地区别IgG型RF和IgM型RF的检测。3dot-aa法检测3.1类风湿因子是一种自身抗体,可分为IgM型RF、IgG型RF和IgA型RF,IgM型RF的滴度与类风湿性关节炎的活动性和严重性成比例,IgG型RF与类风湿性关节炎病人的滑膜炎、血管和关节外症状密切相关,因此,区别IgG型RF和IgM型RF的检测有重要的临床意义。3.2IgG型RF和IgM型RF能和人、动物IgG的FC段特异性结合,尤其是与变性兔IgG结合,鉴于此原理,将变性兔IgG用化学方法交联在硝酸纤维素膜上,用于建立检测IgG型RF和IgM型RF的dot-EIA。3.3100份待检血清用两种方法检测3次的结果显示,每份血清经dot-EIA法检测3次的结果相同,ILA法检测3次,有82份血清检测3次的结果相同,有10份血清2次检测为RF阳性,有8份血清1次检测为RF阳性,说明dot-EIA法及其试剂的重复性和稳定性优于ILA法。3.4将混合阳性血清作倍比稀释后用两种方法检测,稀释度为1/512时,dot-EIA法检测IgG型RF和IgM型RF均为阳性,稀释度≤1/64时,ILA法检测为RF阳性,说明dot-EIA法的敏感度高于ILA法。3.5经dot-EIA法3次检测均为RF阴性的48份血清再用ILA法检测3次,有3份血清1次检测为RF阳性,表明dot-EIA法的特异度高。3.6从表2dot-EIA法检测两类型RF的结果可以看出,dot