固定化啤酒酵母发酵酒精的研究

固定化啤酒酵母发酵酒精的研究

目前，啤酒发酵过程通常采用间歇式，即在麦汁中引入适量的游离啤酒发酵，经过长期发酵，将母芽回收并清洗。这是一项复杂的手术，不仅容易引起各种细菌的污染，而且转化周期很长。固定化细胞培养技术是20世纪60年代发展起来的一种新型生物技术，主要是利用物理或化学的手段将游离的细胞固定于限定区域并保持活性，细胞可反复使用的一种技术。与游离细胞相比，固定化细胞具有生长快、反应快、抗污染能力强、可重复使用、易与产物分离等特点，极大地降低了生产成本。目前越来越广泛地应用于食品、医药、环保与发酵工业。该技术已在啤酒酿造中进行了广泛的研究。固定化酵母的方法有多种，如吸附法、包埋法、交联法等，但是包埋法是近年来发展迅速的一种新兴细胞固定化技术，其主要原理是将微生物封闭在天然高分子多糖类或合成高分子凝胶的网络中，从而使微生物固定化。该方法具有操作简单，对细胞活性影响较小等特点。常用的包埋载体有琼脂、明胶、海藻酸钠、聚乙烯醇和丙烯酰胺，其中海藻酸是最常用的一种包埋剂，它是从褐藻细胞壁或细菌中提取出来的天然多糖，它由1,4-β-D-甘露糖醛酸(M段)和1,4-α-L-古罗糖醛酸(G段)2种结构单元通过α-1,4-糖苷键连接成不同比例的GM段、MM段和GG段，从而形成线性共聚物。本实验从海藻酸钠浓度、CaCl2溶液浓度、壳聚糖覆膜时间研究了固定化小球的硬度，并考察了海藻酸钠浓度、CaCl2溶液浓度、填充量、包埋量在固定化酵母颗粒发酵酒精的最适条件，为工业上用固定化酵母生产酒精作了初步探究。1材料和方法1.1永顺泰宝5.3.安琪啤酒用高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；麦芽：永顺泰宝应麦芽有限公司；壳聚糖：生化试剂，国药集团化学试剂有限公司；其他试剂均为分析纯。1.2培养基活化培养基：4～6°Bx麦汁；增值和发酵培养基：12°Bx麦汁。1.3准备啤酒果汁采用一次煮出糖化法：参考文献。用纱布过滤，滤液煮沸后冷却以析出蛋白，用滤布过滤得澄清麦芽汁，调节糖度至12°Bx。1.4活化安冀酵母用5～10倍干酵母质量的4～6°Bx的麦汁，在温度为30℃活化安琪酵母2h。将活化后的啤酒酵母活化液按体积比1:100的比例接种于12°Bx麦汁中，于28℃、150r/min的摇床中培养24h。1.5海藻酸钠凝胶珠的制备将增殖后的酵母菌悬液(108cfu/mL)和已灭菌的浓度2%海藻酸钠溶液按照1:5充分混匀后，用注射器将该混合溶液滴入已灭菌的3%的CaCl2溶液中，形成大小均匀的凝胶珠，4℃下老化24h。无菌水洗涤3次。1.6发酵将固定化酵母加入到100mL麦汁中11℃下进行发酵。1.7糖度及检出限固定化小球强度：物性仪(TA-XT2i质构分析仪：英国StableMicroSystems有限公司)；残糖糖度：糖度计测定法(WZ112/ATC：北京九合仪器仪表有限公司)；细胞数的测定：采用血球计数板。2结果与分析2.1固定条件2.1.1小鼠形态观察以1%、2%、3%、4%、5%浓度的海藻酸钠溶液，分别滴入3%CaCl2溶液中，老化2h，随机取50粒研究小球的形态，结果见表1。由表1可以看出，随着海藻酸钠浓度的增加，液体的黏度不断增大，小球成型越来越不规整，小球拖尾数越来越多。2.1.2海藻酸钠质量分数对固定化材料硬度的影响以质量分数为1%、2%、3%、4%的海藻酸钠溶液滴入3%CaCl2溶液中制备固定化小球样品，研究海藻酸钠质量分数对固定化小球硬度的影响，结果见图1。从图1可以看出，随着海藻酸钠质量分数的增大，固定化小球的硬度越大，从0.115N增加到1.16N。随着海藻酸钠浓度的增加，单位体积海藻酸钠分子数增加，与Ca2+更易作用，长链之间也更容易堆砌缠结，因此海藻酸钠质量分数增大可以使固定化小球硬度随之增大。海藻酸钠的质量分数低于1%时，与Ca2+交联度低，滴入氯化钙溶液中难于形成球形颗粒。从成形和小球强度来看，质量分数为2%的海藻酸钠成型容易，硬度适中。2.1.3氯化钙浓度对小球强度的影响以浓度为2%的海藻酸钠溶液滴入1%～5%的CaCl2溶液中制备固定化小球样品，研究CaCl2浓度对固定化小球硬度的影响，结果见图2。由图2可以看出，海藻酸钠浓度一定的情况下，随着CaCl2浓度的增加，固定化小球强度先增加后减少，CaCl2浓度从1%增加到3%，固定化小球强度从0.343N增加到0.362N，强度提高了5.5%。CaCl2浓度超过3%，固定化小球强度降低，这可能是由于Ca2+增加，减少了与海藻酸钠2条分子链G块结合形成长链堆砌缠结的机会。总体来说，CaCl2浓度对固定化小球强度影响差异不大。2.1.4糖覆膜对固定化材料硬度的影响以2%的海藻酸钠溶液滴入3%的CaCl2溶液中制备固定化小球样品，将制备好的固定化小球在0.5%的壳聚糖溶液中浸泡一定时间，研究壳聚糖覆膜对固定化小球硬度的影响，结果见图3。从图3可以得出，用壳聚糖浸泡固定化小球对小球的强度没有明显提高，分别对固定化小球覆膜0、30、60、90、120min，小球强度由未覆膜时的0.368N增加到0.408N，最大增加了10.9%，覆膜90min的效果较好。与海藻酸钠对小球强度影响相比，壳聚糖对强度影响不大。考虑到壳聚糖难溶于水，不易吸附在固定化小球表面，此后实验不再用壳聚糖浸泡。2.2固定化栽培条件对发酵残糖量的影响2.2.1胶珠和麦汁中cacl2的浓度对发酵作用的影响按照1.5的方法，将增殖后的酵母菌悬液和已灭菌的3%的海藻酸钠溶液按照1:5比例充分混匀后，用注射器将该混合溶液逐滴滴入已灭菌的不同浓度的CaCl2溶液中，形成大小均匀的固定化凝胶珠，4℃下固定化24h。无菌水洗涤3次。将制成的胶珠按15%加入到100mL12°Bx麦汁中11℃进行发酵，每隔一段时间测发酵液糖度，结果见图4。由图4可以看出，CaCl2的浓度不是影响发酵速度的主要因素，26h后降糖速度仍差不多相同，可能在其他固定化及发酵条件一定的情况下，比如包埋酵母悬液的量一定，发酵可以正常进行，CaCl2的质量分数对于物质传递没有起到干扰。另外，0～2h糖度下降大，考虑到固定化颗粒本身带有自由水，加入到麦汁中对麦汁起到稀释作用。由图5得知，不同浓度的海藻酸钠对于降糖几乎没有影响，降糖曲线基本保持一致，最后糖度也降到几乎一样的水平，说明在麦汁浓度和酵母悬液包埋量一定的情况下，发酵一次海藻酸钠对物质传递没有明显阻碍。2.2.3酵母悬液的制备按照1.5的方法，将增殖后的酵母悬液和已灭菌的3%的海藻酸钠溶液按照不同比例(酵母悬液:麦汁)充分混匀后，用注射器将该混合溶液逐滴滴入已灭菌的质量分数2%的CaCl2溶液中，形成大小均匀的固定化凝胶珠，4℃下老化24h。无菌水洗涤3次。将制成的胶珠按15%加入到100mL12°Bx麦汁中进行发酵，每隔一段时间测发酵液糖度，结果见图6。由图6可知，海藻酸钠包埋酵母悬液的量对于发酵有比较明显的影响，包埋比为1:6时降糖最快，残糖量最低，说明此比例下底物对于酵母菌基本无抑制作用，对物质传递影响小，并且空间合适，满足酵母自身增值和发酵麦汁。包埋比从1:5到1:3降糖越来越快，这说明包埋酵母的量越多越易于与底物麦汁接触进行发酵。但是酵母包埋量的增加会影响固定化颗粒的硬度和浸泡时间，不利用固定化颗粒持续使用。所以包埋量为1:6时发酵效果最好。2.2.4不同填充量胶珠发酵降糖效果的确定按照1.5的方法，将增殖后的酵母菌悬液和已灭菌的质量分数3%的海藻酸钠溶液按照1:5比例充分混匀后，用注射器将该混合溶液逐滴滴入已灭菌的质量分数2%的CaCl2溶液中，形成大小均匀的固定化凝胶珠，4℃下固定化24h。无菌水洗涤3次。将不同量的胶珠按不同填充量加入到100mL12°Bx麦汁中进行发酵，每隔一段时间测发酵液糖度，结果见图7。从图7可以看出，填充量在7～17.5g/100mL范围内，填充越多，发酵降糖越快，残糖量越低。填充量21g/100mL，降糖减慢。说明在一定填充范围内，降糖速度、酒精度与填充量成正比，超过此范围，降糖反而下降。可能由于填充太多，使固定化酵母粒子运动受到限制，不易于麦汁发酵，对糖的消耗能力减弱。所以填充量为17.5g/100mL时最适宜发酵。3海藻酸钠质量分数对发酵降糖效果的影响以海藻酸钠作为固定化载体，考察了3个因素对固定化小球成型和固定化小球硬度的影响，其中海藻酸钠质量分数是硬度的主要影响因素，相比之下质量分数为2%的海藻酸钠成型容易，硬度适中。CaCl2质量分数为3%时硬度最大。将固定化酵母颗粒加入到麦汁中进行发酵，发现海藻酸钠质量分数和氯化钙质量分数对发酵降糖影响不大，而酵母悬液和海藻酸钠的比例及固定化小球的填充量对降糖影响较大，在一定范围内成正比关系。但是酵母悬液包埋量越大对小球硬度有一定影响，也会破坏小球的致密性，很容易破裂。最佳的发酵条件是：酵母悬液和海藻酸钠比为1:6，固定化颗粒填充量