肉鸡全价料菌剂的制备研究

肉鸡全价料菌剂的制备研究

作为食品和饲料行业的主要绿色添加剂，其抗压、储存过程和体内功能过程的抗逆性存在着问题，严重影响了货币价格的持续时间和使用效果。目前国内对益生菌抗逆性的研究涉及耐高温、耐高压等方面,多为简单的实验室模拟试验,但关于工厂化制粒条件下微生物存活情况的研究并不多见,近年仅李卓佳等开展了类似的研究,该试验发现,筛选出的芽孢杆菌经对虾饲料制粒工艺流程后芽孢杆菌存活95%,烘干后芽孢杆菌存活93%,证明芽孢杆菌能够承受饲料制粒生产中压力、温度和水分的变化。至于采用工厂化制粒机将农业部最新公布的安全菌珠添加到无抗肉鸡料中进行系统抗逆性的研究还未见公开报道。由于制粒温度和压力是影响益生菌存活的2个主要因素,本试验通过改变制粒过程中的温度和压力条件,研究益生菌在不同制粒条件下的存活情况,筛选能够耐受制粒的菌株。并在常温常压下对其制剂样品进行保存试验,研究保存时间对其活力的影响。1材料和方法1.1材料表面1.1.1菌株保存培养地衣芽孢杆菌TS-01(Bacilluslicheniformis)、枯草芽孢杆菌TS-02(Bacillussubtilis)为中国农业科学院北京畜牧兽医研究所饲料添加剂研究室保存菌株。干酪乳杆菌TS-04(1.29)(Lactobacilluscasei)、植物乳杆菌TS-05(1.19)(Lactobacillusplantarum)、粪链球菌TS-06(1.130)(Streptococcusfaecalis)、乳链球菌TS-08(1.2030)(Streptococcuslactis)、啤酒酵母TS-10(2.604)(Saccharomycescerevisiae)、产朊假丝酵母TS-11(2.281)(Candidautilis)购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心。1.1.2培养培养基、吸附剂和饲料营养琼脂、mrs培养基、麦芽汁琼脂、肉浓度、蛋白粉、绍皮等1.1.3实验室常规器器饲料制粒机(申德520型)、生化培养箱(广东医疗器械厂LRH-150B型、LRH-250A型)、摇床(哈尔滨东联电子技术开发有限公司HZQ-Q型)、超净工作台(北京半导体一厂)、立式自动电热蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂LDZX-40BI型)以及微波炉、超声波洗涤机、振荡器、搅拌机、粉碎机、电子天平、干燥箱及其他实验室常规器皿。1.2方法1.2.1菌剂的制备菌株接种于发酵液中,于各自最适培养条件下培养,将发酵液按1∶1比例与灭菌麸皮混合,并在混合机上混匀,干燥,用40目筛在粉碎机上粉碎,制得菌剂。1.2.2菌液的配制及培养菌稀释液制备:分别取菌剂1g溶于9mL无菌水中,混匀,取1mL该悬浮液加入到盛9mL无菌水的试管中,混匀,再从刚刚混匀的菌液中取1mL,加入到另一个盛有9mL无菌水的试管中,重复同样操作,酌情对菌液进行稀释。选取3个梯度的菌液,分别取0.2mL加入培养皿中,每个梯度做3个重复。琼脂平板的制备:将营养琼脂溶于盛有250mL蒸馏水锥形瓶中(每3.3g琼脂加100mL蒸馏水)灭菌,取出后等琼脂温度冷却到50℃左右,迅速将其逐个倒入培养皿中,轻轻摇匀。琼脂量一般以能全部覆盖平皿底部为宜。培养:将冷却凝固的平皿倒置,放于培养箱中培养36~48h,培养温度为37℃。菌落计数:取出培养好的平皿,选取菌落在30~300个之间的平皿进行计数。菌数:菌剂活菌含量(个/g菌剂)=平皿上菌落数×5×稀释度。1.2.3菌剂装加量及饲料0.1%的添加量将活菌剂分装,饲料厂制粒机每次的出料量为1.6t,故每种菌剂的添加量为1.6kg。每种菌剂装3个重复,对应3种不同的制粒条件,分别设为A(0.1Mpa,65℃)、B(0.2Mpa,70℃)、C(0.3Mpa,75℃),制粒饲料为华都肉鸡公司无抗肉鸡料(42~49日龄)。取样后用1.2.2进行活菌含量检测。1.2.4受制粒过程的益生菌对上述颗粒料中活菌进行检测,筛选出耐受制粒过程的益生菌株。之后对它们进行常温常压密封保存试验,每隔半个月检测1次活菌含量,共持续3个月。2结果2.1ts-10在a、b、c条件下的死亡率由表1、2可以看出,TS-01、TS-02在3种制粒条件下,活菌含量与制粒前相比,死亡率很低,TS-01为2.69%、3.85%、8.85%,TS-02为0%、3.50%、5.00%;TS-08在A和B条件下,死亡率分别为26.2%、25.4%,在C条件下,死亡率达91.5%;TS-10在A、B、C死亡率分别为8.95%、18.2%、36.1%;TS-04、TS-05、TS-06、TS-11在A、B、C死亡率均非常高。2.2储存时间对抗凝剂活性的影响3讨论3.1细菌热管理系统intet乳链球菌和啤酒酵母在制粒过程中活菌的变化不大,制粒后其死亡率比较低,它们抗逆性比较强的原因可能与菌株自身特性有关。Melchior认为耐热细菌的细胞膜具有特殊的组成,一般含有异型脂肪酸、稳定型脂肪酸和环烷型脂肪酸,而无不稳定的不饱和脂肪酸。增加磷脂酰烷基链的长度,增加异构化支链比率,或增加脂肪酸饱和度,均可以维持细胞膜的整齐状态———液晶态。细菌耐热的另一个可能机制是其蛋白质具有热稳定性,Rainer认为细菌耐热可能与构成蛋白质高级结构的非共价力、结构域的包装、亚基与辅基的聚集,以及糖基化作用、磷酸化作用有关;Milo等发现喜热嗜油芽孢杆菌中的儿茶酚2,3-双加氧酶是不稳定的,但这种酶在高温条件下却维持较高的活力。因此他认为耐热菌耐热可能与细菌本身酶系统迅速更新,从而维持细菌酶正常功能有关。Hollien等认为细菌耐热可能与细胞膜蛋白质个别氨基酸改变引起细胞膜疏水作用和离子间相互作用的增加有关。对于其他4株益生菌,由试验结果可以清楚地看出,制粒对它们的影响很大,死亡率较高,且随着温度和压力的升高,活菌含量明显下降,死亡率显著提高,表现出菌体抗逆性差的特点,说明该4株菌不适合制粒。3.2活菌含量随时间的变化情况有本试验保存条件与实际生产中的条件相符,选用常温常压。对能够适应制粒条件的4株菌进行保存试验,由试验结果可以看出,地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌在3个月的保存期内,活菌含量几乎保持不变,这与它们形成芽孢,极大提高它们的抗逆性有关;啤酒酵母的活菌含量随着时间的推移保持较高水平,这可能与该菌细胞壁坚固的葡聚糖结构有关;乳链球菌随着时间的推移,活菌含量逐步下降,到45d时,活菌含量下降幅度增大,到75d以后趋于平缓,开始阶段活菌含量下降相对较慢,这可能与活菌刚刚脱离营养环境,菌体本身有一定的营养物质储备,能够抵抗短暂的非营养环境有关,但菌体本身的代谢能力和活力在逐步下降,到45d多数菌体本身储备消耗殆尽,抵抗力迅速下降,并丧失代谢能力。在保存过程中,由于部分菌体适应了保存环境,可以持续存活下去,因此在75d以后出现菌体死亡率趋于平稳的现象。4芽孢杆菌的致病性地衣芽孢杆菌TS-01和枯草芽孢杆菌TS-02可以耐受制粒条件,并且在保存试验中活力非常稳定,活菌损失极少;啤酒酵母活菌在制粒和保存试验中均体现出比较好的稳定性,活菌损失比较少;上述3株菌能够抵抗制粒条件,且在3个月的保存时间内仍保持高的活菌含量,为本试验筛选出的优良抗逆性菌株。饲料为北京华都肉鸡公司的无抗生素肉鸡料。由表3可以看出,TS-01、TS-02、TS-10在90d保存期内活菌死亡率分别为2.40%、1.50%、3.50%。TS-08在第1~5天活菌死亡率为2.0%,在第45~75天之间活菌数迅速下降,达93.7%,在第75~90天之间活菌死亡率仍为93.7%。由表1和表2可以看出,地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌在与饲料混合制粒后,活力几乎没有发生变化,可能由于这2株菌在加工成菌剂过程中,逐渐失去了温度、营养和水分的供应,使菌株逐步形成芽孢,在混合制粒过程中,芽孢菌在制粒机中停留时间大约为3~5min,温度不足100℃,而一般认为杀灭芽孢需121℃条件下,持续15~20min,显然制粒温度和时间很难对芽孢菌产生影响。关于芽孢菌能够耐热的机制现在尚无统一说法,其中渗透调节皮层膨胀学说具有一定的代表性,该学说认为,芽