苯酚-硫酸法测定蒙药清热八味散粗多糖的含量

苯酚-硫酸法测定蒙药清热八味散粗多糖的含量

蒙古药物种类繁多，资源丰富，分布广泛。它主要来自自然界植物、动物和矿物，主要以植物药物为主。蒙药是中国传统医学的重要组成部分。明代的清热八味散（蒙语为额日二味散）是保存和使用于西藏和蒙古医学的重要药物。清热八味散主要由檀香山、石膏、红花、苦丁、曲麦、胡黄莲、麦冬、人工黄连等八味散组成。主要用于清热解毒、热、血热、脏腑热、肺热、咳嗽、痰中出血、肝灼烧、肋骨疼痛等疾病。蔡光明等人在开发、分离、提取、结构、药理学研究等方面做了大量工作。蔡光明等人研究了蒙古族清热八味散对大鼠免疫功能的影响。张汉峰等人研究了蒙古族清热八味散（额日二味散）对sd的临床疗效。然而，对于提取和测定蒙药清热八味散的糖含量，没有专门的文献。为了继续开发蒙药清热八味散的水处理方法，这项工作使用了一种传统的苯硫酸-石脑油法，并采用了分光光度法测定总糖含量。为了研究蒙药清热八味散的提取、分离和提取以及不同的提取条件，提出了评价蒙药清热八味散糖含量的理论依据。1材料和机器的试剂1.1材料：蒙药清热八味散内蒙古民族大学附属医院，批号：20071311.2实验仪器FA2104电子分析天平(上海恒平科学仪器有限公司);722S可见分光光度计(上海精良科学仪器有限公司公司);DHG-9070电热恒温古风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司);SHZ-D(III)循环水式真空泵(巩义市英峪予华仪器厂);W2-100SP旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司).乙醇、乙醚、丙酮、葡萄糖、苯酚、浓硫酸等均为分析纯.实验用水为双蒸馏水.2方法和结果2.1灰色粗多糖的制备称取清热八味散样品5.92g,放入500mL烧瓶中,加入适量蒸馏水,水浴加热,温度为80℃,提取3次,合并提取液,旋转蒸发浓缩,加乙醇醇析,使含醇量达到80%,静置24h,抽滤,用乙醇、丙酮、乙醚分别洗涤3次,干燥后得灰褐色粗多糖0.38g.2.2标准曲线的绘制2.2.1标准葡萄糖溶液及供试品溶液的配制(1)标准葡萄糖溶液的配制:精确称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖25mg,加适量水溶解,转移至250mL容量瓶中,加蒸馏水至刻度并摇匀,即配成浓度为0.01mg/L标准葡萄糖溶液,5℃冰箱储存备用.(2)5%苯酚试剂的配制:称取5.0g苯酚,加适量水溶解,转移至100mL容量瓶中,加蒸馏水定容,摇匀后转移到棕色试剂瓶中,放入冰箱备用.(3)供试品溶液的配制:准确称取粗多糖50mg,加适量水溶解,转移至100mL容量瓶中,加蒸馏水定容,摇匀,制成0.5mg·mL-1的供试品溶液.2.2.2最大吸收波长的确定原理:硫酸-苯酚试剂可与游离的寡糖、多糖中的己糖、糖醛酸起显色反映,己糖在490nm(戊糖在480nm)左右处有最大吸收,吸收值与糖浓度呈线性关系.精确吸取1.0mL葡萄糖标准溶液于10mL比色管中,加入5%的苯酚溶液1.0mL,摇匀,然后加浓硫酸5.0mL,放置10min,加蒸馏水定容,充分摇匀,室温放置30min,同时做一空白实验,在400~600nm范围内用紫外分光光度计进行全波长扫描,最后确定最大吸收波长为490nm.2.2.3线性关系的考察2,0.4,0.6,0.8,1.0mL置于五个10mL比色管中,各加入5%的苯酚溶液1.0mL,摇匀,然后加浓硫酸5.0mL,放置10min,加蒸馏水定容,充分摇匀,室温放置30min,同时做一空白实验,在490nm处测定吸光度,以吸光度(A)对浓度(C)线性回归计算,得回归方程A=23.1375C+0.0299,r=0.9992,样品在20-100μg/mL的范围内呈良好线性关系.2.3称取5份样品中的8种干燥药物，按照试验溶液的方法制备干燥溶液，准确提取0.6ml，然后根据标准曲线的制备方法测定a的吸收。对于八个干分解中的糖含量，表1显示了相应的计算方法2.4在加标回收率试验中，准确测定了5个已知含量的样品溶液，加入葡萄糖标准溶液，并以2.2.3的方式在最大吸收波长为490nm的样品吸收中测量回收率。结果表明，回收率的平均值如表2所示。该方法显然具有良好的回收率2.5在精密度试验中，正确测定了6份标准葡萄糖溶液，分别为1.0ml。然后在方法2.2.3中测量最大吸收波长为490nm的吸收。因此，吸收值为sd=0.77%n.6，表明仪器的精密度良好2.6对稳定性试验的精确量取0.5ml试验溶液，并以2.2.3的方法，在最大吸收波长为490nm的条件下分别测量吸收，并连续测量6次。吸收值a的psd=0.58%n.6，样品溶液在出现后至少在3小时内保持稳定2.7在重复试验中，正确称取5个糖样，每10mg，加水溶解，定容至25ml。吸收率由模式2.2.3测量，最大吸收波长为490nm。因此，吸收值为sd=0.92%n.5，表明重建效果良好3蒙药热重八味散中多糖含量的测定(1)苯酚-硫酸法较为稳定,而且不同的多糖和单糖显色反应后显示不同的最大吸收峰,是较为理想的多糖测定方法.进一步通过稳定性、精密度、重复性和加标回收率等方法学实验说明该方法不仅准确可靠,简便快速,正确率和精密度高,而且重现性好,颜色稳定,可作为蒙药清热八味散中多糖含量的测定方法.(2)苯酚溶液易被氧化,实验时应现配现用.(3)由于多糖的生物活性与其纯度和化学结