浓盐法和氨解法提取rna的比较

浓盐法和氨解法提取rna的比较

0品种及用量对na合成的影响努伦（核糖酸）是重要的生物遗传材料，主要分布在物质中。这是蛋白质合成的指标。RNA主要有三大类,其中,核糖体RNA(rRNA)占RNA总数的80%以上,一般从酵母中提取的大分子RNA主要是rRNA。核酸大分子的不完全水解产物中有核苷和核苷酸。其中鸟苷酸(GMP)和肌苷酸(IMP)是强力助鲜剂,胞苷酸(CMP)和尿苷酸(UMP)可作为生产治疗癌症、肝炎及冠心病等药物的原料。在化妆品中加入核酸或其水解物,可促进皮肤蛋白合成,达到养护皮肤的作用。在农业上,RNA降解物具有促进作物生长增产的作用,已在水稻、小麦、柑橘及多种蔬菜中生产应用,取得了明显的增产效果。目前,我国的核酸工业虽然取得了一定的进展,但同欧美、日本相比仍然比较缓慢。从啤酒酵母中提取RNA的工艺方法很多,本文主要就浓盐法和氨解法进行研究和比较。1材料和方法1.1原材料啤酒酵母,由本系微生物实验室提供。供试菌种处于对数期,此时含RNA最丰富,约为6%～8%。1.2主试剂食盐、盐酸、氨水、乙醇、钼酸铵、过氯酸、三氯乙酸、硫酸1.3主要设备TDL-5离心机、721分光光度计、pH计、电热恒温干燥箱、501型超级恒温器1.4方法1.4.1不易搅拌的溶液称取10g供试酵母,配成10%酵母溶液。若浓度太高,溶液成糊状,不易搅拌;浓度太低,调上清液等电点时RNA不易沉淀,因为RNA在水溶液中有一定的溶解度。1.4.2杂蛋白凝胶液的制备核酸提取主要分三步进行:(1)破壁,使核蛋白从细胞中溶出。(2)加热,使杂蛋白变性沉淀。(3)离心,使核酸与蛋白分离,得RNA清液,再调RNA等电点,使RNA粗品沉淀,经纯化、干燥得到成品。1.4.3脱核酵母菌体分离通过盐溶液产生较大的细胞渗透压,使细胞破裂,释放出核蛋白体,从而使核蛋白体与酵母菌体分离。由于RNA钠盐易溶于水,在含盐的菌体溶液中,RNA有较高的溶解度,这样,通过控制温度使蛋白质变性沉淀,通过离心将RNA及蛋白质和脱核酵母菌体分离,从而达到提取之目的。酵母液→盐处理→快速加热→抽提保温→迅速冷却→离心分离→上清液→等电点沉淀RNA→乙醇洗涤→干燥→RNA干品1.4.4确定核酸生产电点及其方法,将酸用1.0%氨水处理酵母细胞,是通过稀碱作用将酵母细胞壁中的脂溶性物质溶解,使核酸溶出,采取分步调等电点的方法:加三氯乙酸使蛋白质沉淀,同时用硫酸调蛋白等电点4.2,除杂蛋白,将核酸上清液用盐酸调核酸等电点2.3,离心后得核酸粗品,用70%酒精洗涤得核酸产品。酵母液→氨水破壁→离心分离→上清液→分步调等电点→乙醇洗涤→干燥→RNA干品1.4.5国各基因中核酸中nd值的计算A.上清液中RNA的测定分光光度法:上清液→调pH为7→取1mL稀释500倍→测OD值→计算规定1mg/mL溶液A260=20,则RNA%=A26020×500×1001000%=A26020×500×1001000为100mL溶液中RNA的含量B.RNA干品纯度测试方法精确称量0.5g粗核酸粉→研磨→加10mL水→5%氨水调pH为7→50mL容量瓶→冰箱冷置30min→离心分离→取0.5mL定容50mL→测OD。取两支10mL离心管,按下式操作:(1)样品实际浓度=0.550ml×42×500.5=50ug/ml=0.550ml×42×500.5=50ug/mlRNA%=甲OD260±−乙OD260±0.022×50×100%‚0.022RΝA%=甲ΟD260±-乙ΟD260±0.022×50×100%‚0.022是浓度为1ug/mL的RNA溶液的OD值甲液OD260为总的核酸,核苷酸的值,乙液OD260为核苷酸小分子的值,两者之差即为核酸大分子的值。(2),纯RNA溶液的A260/A280值为2.0,样品中若含有蛋白质,则A260/A280值要下降,因为蛋白质的最大吸收峰在280nm。2结果与讨论2.1循环使用上清液此方法研究和应用最为普遍,本人经实验得出的最佳工艺条件是:取10%的酵母液,加盐浓度为10%,加热温度为92℃,加热时间为4h。一般得率在2.6%左右,纯度在74.5左右。由于提取RNA后的上清液中仍含有一定量的RNA,所以采用循环使用上清液的方法,既省水,又省盐。下面主要分析一下上清液的循环使用情况。由上表可知,同样条件下,使用第二次循环上清液,即循环两次,抽提的RNA的净得率最高。2.2氨基法提取的钠2.2.1氨法的破裂条件采用酵母质量分数10%,氨1.0%,破壁温度为60℃,不同时间不同量做正交实验如下:时间对提取nat的影响从上表看出,时间的极差不是最大,即时间不是最大影响因素,时间取40min为最佳。最佳配比的确定从上表看出,三氯乙酸的极差也不是最大,即说因素B也不是最大因素,三氯乙酸含量取5%为最佳。通过对指标影响分析得出较好的实验方案是:A2时间第二水平40minB3三氯乙酸量第三水平5%考虑经济因素,三氯乙酸价格较贵,加2%与5%的量对RNA得率差别不大,所以通常加2%的沉淀剂。2.2.2提取核酸结果基于正交实验的结果,考虑破壁时间的影响,做补充实验:采用酵母质量分数10%,氨1.0%,在60℃分别破壁30min、40min、50min,加2%三氯乙酸,用H2SO4调蛋白等电点4.2,离心去杂蛋白,再提取。结果见表5提取核酸后得上清液,核酸含量测定如表6:由以上两表可以看出,破壁50min时核酸产量最多,上清液中杂质多,残留的核酸液多,可知破壁时间长,核酸溶出多,同时其他杂蛋白也较多溶出,从核酸中的百分含量也可以看出50min最好。若破壁时间短,虽然核酸纯度高,上清液中核酸残留量少,但最终百分含量低,所以不可取;若时间过长,其他杂质溶出量大于核酸溶出量,影响核酸的等电点提取,所以也不可取,综上可得,氨解法破壁时间为50min时最佳。2.3两种方法的比较3活性核酸的提取3.1核糖核酸定性定量的测定采用紫外分光光度法,操作简单方便,误差小。3.